一种快速检定番荔枝花粉生活力的方法

本发明属于番荔枝花粉检测领域，具体涉及一种快速检定番荔枝花粉生活力的方法。

背景技术：

1、番荔枝又称释迦，为番荔枝科（annonaceae）番荔枝属（ annona）多年生半落叶性小乔木，在我国热带及亚热带地区（福建、广东、广西、云南、海南等地）拥有超过400年栽培历史，近年来随着香蕉、芒果、甘蔗等传统热区作物/果树种植发展趋于饱和，番荔枝逐年受到追捧，成为新的增长点。然而其相关栽培技术在我国仍处于初级阶段，理论研究与实际生产种植仍然存在很多待优化的方面。介于此，对番荔枝生产及科研中一些关键问题开展针对性的探索意义重大。

2、人工授粉是是指用人工将植物花粉传送到柱头上完成受精的技术措施，在生产上它是提升番荔枝品种座果率和果实品质的重要手段，同时对于番荔枝种质资源创新而言，其也是新种质创制的重要实现技术之一。现有的番荔枝授粉的方法主要有以下两种：

3、1.自然授粉（风媒虫媒等）：利用空气流动及昆虫等自然行为完成授粉。优点：前期省工；缺点：针对生产主栽品种ap番荔枝、凤梨释迦等，产量极低，果形不端正，果实成熟时期分散，采收不便，低投入低产出。

4、2.人工授粉方法：手工收集花粉，对可授状态的雌蕊进行人工授粉操作。具体为：

5、分批次修剪（按照市场需求及果实发育期进行计算），待群体临开花前雌花进行可授状态检查（环境温湿度是否适合，柱头是否发育正常，是否湿润有粘液覆盖），开花前约4-6h进行授粉树集中临成熟花朵的收集，阴凉处批量分散存放，待雄蕊花药自然爆开后，收集花粉

6、对开花前一日处于雌蕊成熟状态的花朵进行涂抹授粉。优点：可根据市场批量集中授粉，集中优化管理，同步化果实成熟期，果实端正，品质高，投入产出比较前两种方式高。缺点：花粉收集需要每个授粉日提前进行，需要耗费人工。且花粉存在较明显的花粉活力波动，甚至出现花粉败育，导致授粉效果不佳费时费工的问题产生。

7、上述比较可以看出，对番荔枝花人工授粉是目前最佳生产解决方案。对于人工授粉而言，充分的授粉和座果率高度依赖于足够的花粉活力，对于储存备用或者临成熟阶段的花粉的精确活力判断无论对番荔枝杂交试验科学研究的顺利开展或者生产上人工授粉均具有重要意义。

8、多数番荔枝存在修剪后固定天数抽稍成花的特性，因此在合适的季节人工差异化修剪可对不同番荔枝花期进行同步化调控。但仅此无法获得理想授粉结果。雌雄蕊的互作在临开花时候是复杂的，番荔枝花是完全花（每朵花包括功能完整的雌蕊群与雄蕊群），存在明确的雌性期与雄性期，大部分品种为雌蕊先熟，开花过程包括花瓣开裂、快速张开（雌蕊成熟期），柱头粘液消失、雌蕊群褐化（雌蕊衰老、可授性丧失），花药爆裂、花粉释放（雄蕊成熟期），这样的特性注定了花粉与柱头最适授粉时期存在天然时间差，无法同步。主栽品种ap番荔枝和凤梨释迦的花粉一般在下午或傍晚成熟，晚间8-11点为生产上的授粉时间。

9、花粉活力主要取决于环境温度、湿度与花粉状态（水分含量、成熟度、内容物）以及上述诸因素的综合。番荔枝科植物花粉由于花粉含水量高，对干燥敏感，其开裂后不能长时间存活。花期温度湿度对发育进程及雌雄蕊活力影响十分明显，干旱高温会导致花发育异常，花粉败育，而过高湿度亦能影响花药开裂散粉。因此对于花粉活力的判断和快速，对于番荔枝人工授粉效率的提高具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提供了一种快速检定番荔枝花粉生活力及发育阶段的染色方法，不仅能对花粉进行活力检测，亦能进一步对其发育时期及细胞核动态进行示踪，为生产上花粉活力检测及开展花粉萌发过程理论研究提供方便。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种用于番荔枝花粉染色的混合液，以混合液计，包括以下质量浓度的组分：蔗糖6-16%、椰子乳（ccm）0.1-1%、硝酸钙（ca(no3 ) 2·4h2o）250μg/ml、硫酸镁（mgso 4·7h2o）200μg/ml、硝酸钾（kno3）100μg/ml、硼酸（h3bo3）100μg/ml、peg8000 5%，荧光素二乙酸酯（fda）20-50μg/ml、碘化丙啶（pi）3-10μg/ml。

4、进一步，所述的用于番荔枝花粉染色的混合液，以混合液计，包括以下质量浓度的组分：蔗糖6-16%、椰子乳0.1-1%、硝酸钙 250μg/ml、硫酸镁 200μg/ml、硝酸钾100μg/ml、硼酸100μg/ml、peg8000 5%，荧光素二乙酸酯20-50μg/ml、碘化丙啶3-5μg/ml。

5、进一步，所述的用于番荔枝花粉染色的混合液，以混合液计，包括以下质量浓度的组分：蔗糖6-16%、椰子乳0.1-1%、硝酸钙250μg/ml、硫酸镁 200μg/ml、硝酸钾100μg/ml、硼酸100μg/ml、peg8000 5%，荧光素二乙酸酯20μg/ml、碘化丙啶3μg/ml。

6、以上所述的一种用于番荔枝花粉染色的混合液的制备方法，包括以下步骤：

7、（1）取配方量的荧光素二乙酸酯先使用少量丙酮溶解完全，以刚好将溶质全部溶解为上限，备用；

8、（2）取配方量的碘化丙啶使用去离子水溶解；按照配比添加蔗糖、椰子乳、硝酸钙、硫酸镁、硝酸钾、硼酸和peg8000，加入去离子水溶解蔗糖、椰子乳、硝酸钙、硫酸镁、硝酸钾、硼酸、peg8000，直至体积约为总体积的95%，加入步骤（1）已经溶解的荧光素二乙酸酯，统一定容即可。

9、一种快速检定番荔枝花粉生活力的方法，包括以下步骤：

10、（1）雄蕊预处理

11、将花药分散备用；

12、（2）试剂混合孵育

13、将待测花粉转移至硅胶染色板样品槽内，滴加以上所述的混合液，移液枪反复吸吐以充分反应，避光静置30s后滴加至载玻片，加盖盖玻片；

14、（3）荧光镜检

15、宽场荧光显微镜：选择bf、wg与wb通道分别作明场、红色荧光与绿色荧光观察与图像采集，明场用于花粉外观、聚合情况检测，红色荧光用于花粉细胞核数量检测、绿色荧光用于花粉活力检测；

16、激光共聚焦显微镜：激发光选择488nm激光束，检测光波长520nm处收集荧光素二乙酸酯的绿色荧光、647nm处收集碘化丙啶的红色荧光；同时补充收集esid的明场信号观察花粉外观；对上述三个信号进行图像采集；

17、（4）数据统计

18、对获得的不同通道图像使用软件进行计算统计，计算花粉活力。

19、进一步，所述的步骤（1）中，如果是临开花花粉爆出（爆粉）的状态，或者是贮存的花药，直接取出花药即可下一步处理；如果是更早的未离体的花药，需要使用镊子将花药打散，以便从花上分离下来。

20、进一步，所述的步骤（2）中，每10枚花药滴加9-20μl以上所述的混合液。

21、进一步，所述的步骤（2）中，移液枪反复吸吐5次；避光静置30s；盖玻片为6mm直径圆形盖玻片。

22、进一步，所述的步骤（4），所述的花粉活力的计算方法为：花粉活力=产生绿色荧光的花粉数目/花粉数目*100%，和/或花粉活力=花粉内不被着色的花粉数目/花粉数目*100%以综合判定）

23、进一步，所述的步骤（4）采用imagej软件进行计算统计。

24、本发明的有益效果：

25、本发明所述的混合液及检测方法具有以下优点：

26、采用本发明所述的混合液进行花粉活力检测，比传统的fda-pi双染色拥有更持久的荧光寿命，花粉一定时间内维持形态不爆裂，最长可以维持10h，能持续观察到体外萌发过程，利于对花粉活力的检测结果进行验证，提高检测结果的准确度。

27、混合液用量每次可以低至10μl（试剂浓度fda 20μl/mg及pi 3.0μl/mg）荧光试剂用量大幅度降低，毒性减低，总消耗量相对于常规的100μl每次可以大大降低。

28、除了能佐证fda对细胞活力的鉴定结果，亦能够部分充当细胞核染色的角色，本混合液对于细胞核的染色能力可部分取代dapi。对于活力低的样品直接染色wg通道或647nm观察统计细胞核情况，对于高活力样品仅需要增加一步额外的灭活处理亦能数出花粉细胞核数目，帮助花粉发育阶段的确定，与花粉活力检测结果可以相互印证，便于综合判断花粉活力。

29、相较清水分散外观检定、ttc、碘碘化钾常规染色鉴定而言，结果更可靠。

30、染色速度更快，没有离心等过程，对于牛心番荔枝、黄龙番荔枝、非洲骄傲、凤梨释迦、泰国番荔枝等均可以实现染色，操作更加简便。