一种革胡子鲶发酵中药饲料添加剂及其制备方法和应用

本发明涉及水产饲料添加剂领域，具体的说是一种革胡子鲶发酵中药饲料添加剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、革胡子鲶又称埃及胡子鲶，原产于非洲，属热带、亚热带性鱼类，其营养丰富，蛋白质含量高，味道鲜美，具有滋补和药用的价值，可空气呼吸，耐肥水，耐低氧，耐长途运输，对环境适应性强，生长速度快，养殖周期短，是以动物性饵料为主的杂食性鱼类，单产高，在全国各地均有养殖。随着革胡子鲶高密度集约化养殖的大面积推广，各种病虫害频发，特别是细菌性疾病给革胡子鲶的养殖带来了巨大的危害。抗生素具有用量少，杀菌效果好，疗效显著等优点，是实践中革胡子鲶细菌性疾病治疗的首选药物。恩诺沙星属于抗生素中的氟喹诺酮类药物，口服后吸收迅速、完全、半衰期长，具有体内分布广泛、与其它抗菌药物无交叉耐药性、毒副作用小等优点，对嗜水气单胞菌、温和气单胞等有害菌引起的革胡子鲶出血性败血症、肠炎等细菌性疾病具有显著效果，革胡子鲶养殖过程中使用恩诺沙星作为治疗药物的现象非常普遍。但恩诺沙星也存在药物残留、抗药性等问题，给革胡子鲶的品质和恩诺沙星的安全使用带来了隐患。按照我国水产品标准，恩诺沙星的残余量低于0.1mg/kg才能上市销售，一般情况下，革胡子鲶内服恩诺沙星后，降至安全标准需12-15天，方可具备出塘上市条件。革胡子鲶属于热带鱼，在我国大部分地区养殖周期短，上市时间往往和价格密切相关，因此，如何有效快速降低革胡子鲶中抗生素残留的制剂及其方法是当前水产行业迫切需要解决的问题。

2、现有技术中公开有将中药发酵后用于动物的报道，如申请号为201410015670.0的中国发明专利公开了一种复合微生物活性添加剂及其应用，将山楂、当归、五味子等中药粉碎后加入地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等微生物发酵，发酵产物在使用时可与抗生素同时使用，既可以保护内脏器官不受损伤，又可加速代谢毒物的排放，降低药物残留问题，但其主要用于畜禽，且其不具有专一性，有可能有潜在的用药风险。

3、现有技术中也公开有将中药原料直接使用加速鱼类抗生素代谢的包含中药的制剂及其制备方法，如申请号为201710885611.2的中国发明专利公开了一种安全使用抗生素的鲶鱼饵料及其制备方法，将杜仲、七叶莲、草酸、丙氨酸等活性成分和抗生素庆大霉素加入鱼粉、豆粕、棉粕等辅料中，制得的动物饵料能够加快降低鲶鱼体内抗生素庆大霉素的代谢速度，降低残留的作用。但是，其技术存在的缺陷是，第一，将中药原料粉碎后直接加入饲料中使用，中药中活性成分大多存在于植物细胞或细胞间质中，处于中药细胞壁和果胶的包裹中，而鱼类肠道内又大多缺乏打破中药细胞壁、细胞间质束缚，使中药活性成分溶出的相关酶系，因此鱼类利用率很低，尤其是肉食性鱼类更是如此；第二，大部分中药苦涩味明显，鱼类不喜摄食；第三，该方法仅对鲶鱼口服庆大霉素有效，对于其它鱼类和其它种类的抗生素没有明显效果。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种革胡子鲶发酵中药饲料添加剂及其制备方法和应用，以解决革胡子鲶养殖过程中恩诺沙星药物残留，休药期长的技术问题。

2、为了解决以上技术问题，本发明采用的具体方案为：一种革胡子鲶发酵中药饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：s1：分别对枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和扣囊复膜酵母进行活化培养和扩大培养，得到枯草芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液和扣囊复膜酵母种子液，备用；s2：按照重量份数取牡丹叶70-90份，黄芩50-70份，猪毛菜30-50份，五倍子20-40份，山楂20-40份，虎杖20-40份，银杏20-40份，连翘20-40份，大黄20-40份，白术15-25份，石榴皮15-25份，粉碎，混合均匀，得到中药粉末，备用；s3：按照重量份数取豆粕粉60-80份，玉米芯颗粒60-80份，麸皮100-120份，矿物盐溶液100份，步骤s2所得的中药粉末450-490份，加入340-400份自来水或蒸馏水，混合均匀，蒸汽灭菌，得到固体发酵培养基，备用；s4：向上述固体发酵培养基中按照重量份数接入上述扣囊复膜酵母种子液12-15份和枯草芽孢杆菌种子液24-30份，混合均匀，控制温度为28-32℃，通入灭菌空气或氧气发酵16-22h；停止通入灭菌空气或氧气，接入植物乳杆菌种子液48-60份，搅拌均匀，控制温度为30-36℃，继续发酵36h-48h，得发酵中药；s5：向发酵中药通入40-50℃热风风干，粉碎，即得革胡子鲶发酵中药饲料添加剂。

3、作为上述技术方案的进一步优化，枯草芽孢杆菌种子液中枯草芽孢杆菌数、植物乳杆菌种子液中植物乳杆菌和扣囊复膜酵母种子液中扣囊复膜酵母菌数均为3-8×108个/ml。

4、作为上述技术方案的进一步优化，扣囊复膜酵母、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的接菌比为1:2:4。

5、作为上述技术方案的进一步优化，所述玉米芯颗粒的制备方法为，选择洁净、干燥、无霉菌污染的玉米芯，在粉碎机中粉碎成直径5-10mm的小块，即得到玉米芯颗粒。

6、作为上述技术方案的进一步优化，所述矿物盐溶液的制备方法为，按照重量份数，称取磷酸二氢钾30-40份，磷酸氢二钾60-70份，氯化钠40-50份和硫酸镁6-8份装入容器中，倒入100份自来水或蒸馏水，充分融化，即得到矿物盐溶液。

7、作为上述技术方案的进一步优化，所述枯草芽孢杆菌的活化培养和扩大培养方法为：

8、活化培养：将枯草芽孢杆菌菌种放入37℃培养箱中4-6小时，接入牛肉膏蛋白胨培养基中，在摇床转速200rpm/min，37℃条件下培养24小时，得到活化培养后的枯草芽孢杆菌；所述牛肉膏蛋白胨培养基，每升培养基中含有牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，余量为水，ph值7.2-7.5；

9、扩大培养：取活化培养后枯草芽孢杆菌接入枯草芽孢杆菌扩大培养基中，摇床转速200rpm/min，37℃培养24小时，添加枯草芽孢杆菌扩大培养基调整活菌数使枯草芽孢杆菌数为3-8×108个/ml，即得到枯草芽孢杆菌种子液；所述枯草芽孢杆菌扩大培养基，每升培养基中含有玉米粉10g，葡萄糖5g，豆饼粉20g，碳酸钙5g，硫酸铵1g，磷酸氢二钾0.3g，七水合硫酸镁0.2g，水合硫酸锰0.2g，余量为水，ph值7.0-7.5。

10、作为上述技术方案的进一步优化，所述植物乳杆菌的活化培养和扩大培养方法为：

11、活化培养：将植物乳杆菌于34℃条件下培养4-6小时，再接入mrs培养基中，置于34℃静置培养18-24小时；所述mrs培养基，每升培养基中含有蛋白陈10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，1.0ml吐温80，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，余量为水；

12、扩大培养：将活化培养的植物乳杆菌接种到植物乳杆菌扩大培养基中，34℃静置培养24h，添加植物乳杆菌扩大培养基调整活菌数使植物乳杆菌数为3-8×108个/ml，即为植物乳杆菌种子液；所述植物乳杆菌扩大培养基中各成分的质量百分比为，豆芽汁5％，番茄汁10％，马铃薯5％，蔗糖2％，食盐4％，余量为水。

13、作为上述技术方案的进一步优化，所述扣囊复膜酵母的活化培养和扩大培养方法为：

14、活化培养：将扣囊复膜酵母于30℃条件下培养4-6小时，接入ypd液体培养基中，置于30℃，摇床转速180rpm/min，培养18-24小时，得到活化后扣囊复膜酵母菌液；所述ypd液体培养基，每升培养基中含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸膏10g，余量为水；

15、扩大培养：将活化培养的扣囊复膜酵母菌液接种到扣囊复膜酵母扩大液体培养基中，然后置于摇床转速180rpm/min，温度30℃条件下培养18-24h后，添加扣囊复膜酵母扩大液体培养基，调整浓度使扣囊复膜酵母菌数3-8×108个/ml，得到扣囊复膜酵母种子液；所述扣囊复膜酵母扩大液体培养基：每升培养基中包括葡萄糖50g，硫酸铵10g，尿素5g，酵母膏20g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1.2g，余量为水，调整ph值至5.5，蒸馏水1000ml。

16、一种上述制备方法得到的革胡子鲶发酵中药饲料添加剂。

17、一种革胡子鲶发酵中药饲料添加剂在降低恩诺沙星药物残留、预防革胡子鲶出血性败血症、治疗革胡子鲶出血性败血症中的应用，在饲料中用量为饲料质量的2-3％。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

19、1、在开发革胡子鲶抗病、促生长添加剂过程中，意外发现本发明所述的发酵中药饲料添加剂具有加快恩诺沙星在革胡子鲶体内代谢速度，去除恩诺沙星药物残留，缩短休药期的作用，对其它鱼类和抗生素未见显著效果，具有专一性。在恩诺沙星停药后给予发酵中药饲料添加剂，相较于恩诺沙星正常代谢，肌肉中恩诺沙星含量达到休药期标准的时间缩短了40％。

20、药物在生物体内的转化、清除主要通过药物代谢酶起作用，细胞色素p450(cyp450)在动物、植物、鱼类等生物体中广泛存在，是一组含血红素的同工酶超家族，是药物转化过程中最重要的代谢酶系，常常是药物从体内消除的限速步骤，所以cyp450酶的活性与药物的清除率有直接的关系。细胞色素p450是一类由不同数量的氨基酸组成的蛋白质,迄今已发现2000种以上的cyp450酶，不同生物种类的cyp 450酶的亚型及其表达数量均有较大差异。药物的代谢速度和残留时间往往和cyp450的诱导和抑制有关。药物不同，激活或抑制特定的一种或数种cyp450酶，不同生物种类，其cyp450酶的具体种类和表达量往往有较大差异，同种生物使用不同的药物，可以激活完全不同的cyp450酶，同一种药物在不同的生物使用，激活或抑制具体酶的种类也有较大差异。恩诺沙星对革胡子鲶cyp450具有抑制作用，有利的一面是恩诺沙星药效持久，带来良好的预防、治疗效果，不利的一面是恩诺沙星在鱼类体内消除缓慢，残留严重，需要较长的时间才能降至安全浓度以下。本发明所用复方中药中的黄芩苷、没食子酸等活性成分对革胡子鲶cyp450具有诱导作用，明显加快恩诺沙星在革胡子鲶体内的代谢，经发酵后，没食子酸、黄芩苷等活性成分从中药细胞中更易溶出，诱导降解恩诺沙星的cyp450酶的相关基因高效、迅速表达，使得cyp450酶活性显著提高，使得恩诺沙星快速得以降解、排出体外。由于不同鱼类cyp450酶的种类及表达量的差异，同样的中药或中药复方对不同鱼类激活或抑制cyp450酶的具体种类和效果有较大差异，从而造成发酵中药添加剂对其它常见养殖鱼类，如鲤鱼、鲫鱼，未表现出明显的去除恩诺沙星残留，缩短休药期的作用，对其它抗生素，目前还没有发现明显的降解效果。

21、2、本发明所述的革胡子鲶发酵中药饲料添加剂，对革胡子鲶出血性败血症等疾病具有显著的预防效果。使用发酵中药添加剂后，革胡子鲶成活率提高了65％。中药经发酵后，微生物的“破壁效应”使中药细胞中的营养成分和有益成分极易被鱼类利用，促进中药有效成分在鱼体内的吸收、运输和代谢，提高中药药效。复方中大黄、黄芩等对嗜水气单胞菌和葡萄球菌等多种肠道菌和鱼类病原菌有直接杀灭作用，改善肠道环境，有利于乳酸菌和枯草芽孢杆菌在肠道内的定植。另一方面枯草芽孢杆菌和乳酸菌发挥“生物夺氧”、“空间竞争”和“食物竞争”等抑制有害病菌的繁殖，并且微生物发酵过程中产生大量小肽、有机酸和多种维生素等，对免疫系统也起到一定的促进作用。

22、3、本发明所述的革胡子鲶发酵中药饲料添加剂，对革胡子鲶出血性败血症等疾病具有一定的治疗效果，和恩诺沙星联用后，治疗效果显著。饲料中添加2.5％的发酵中药添加剂对感染嗜水气单胞菌的革胡子鲶进行治疗，和未添加中药的阳性对照组相比较，成活率提高了25％，恩诺沙星和发酵中药联用后，相比较阳性对照组，成活率提高了80％，相比较恩诺沙星组，提高了22.5％。这可能是因为发酵中药本身对出血性败血症有一定疗效，发酵中药添加剂又促进了革胡子鲶对恩诺沙星的吸收。

23、4、本发明所述的革胡子鲶发酵中药饲料添加剂，适口性好，能显著促进革胡子鲶的生长，提高成活率，降低饵料系数。经混合菌种发酵后，产生了一定量的菌体蛋白以及大量维生素、乳酸等微生物代谢产物，植物原料及中药中大分子的蛋白质、淀粉等分解成小肽、氨基酸、葡萄糖等小分子物质，组成植物细胞壁的纤维素、半纤维素等转化为可被革胡子鲶利用的成分。中药中含有黄酮、苷类等活性物质，这些成分具有促进食欲，增强机体代谢活动，促进消化酶分泌等作用，加速水产动物的生长发育，经发酵后，这些物质更易被鱼类利用。

24、5、本发明所述的革胡子鲶发酵中药饲料添加剂，对革胡子鲶安全，无任何毒副作用，即使超量使用(≤5％)也没有任何毒副作用产生。

25、6、本发明所述革胡子鲶发酵中药饲料添加剂的制备方法中，所述的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和扣囊复膜酵母为常用菌种，不依赖菌种的特定菌株，经多次试验，从不同保藏机构和生物制品企业购得菌种均能达到预定效果。使用的中草药均为市场上常见的中草药品种，绿色天然，价廉易得，添加到饲料中，无富集，无残留，不污染水体。