一种水凝胶复合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物材料和生物医学领域，具体涉及一种水凝胶复合物。

背景技术：

1、水凝胶，是一类含有大量亲水基团，但不溶于水的三维网络结构聚合物。其中，生物基水凝胶是以天然高分子材料，包括纤维素、淀粉、甲壳素、海藻酸钠、透明质酸为主体通过物理或化学交联制成的水凝胶。生物基水凝胶的成分结构及理化性质类似干细胞外基质，具有良好的生物相容性、可降解性、刺激响应性等，结合其固有的多孔结构和吸水溶胀等特性，使其在药物传递、组织工程、生物传感、环境卫生等领域得到了广泛的研究和应用。近年来，基于水凝胶结构与天然细胞外基质相近，该类水凝胶具有利于细胞存活、生物相容性好、植入创伤小、便于填充等优点，成为最具潜力的组织工程支架材料，被广泛应用于生物医学领域。

2、据统计，我国每年有2600万人被烧烫伤，平均每天近7万人面对烫伤创面的治疗，严重和广泛的烫伤需要专门的医疗保健和长期住院，导致高昂的社会成本。在严重的病例中，治疗选择是有限的，死亡率可能达到100％；尽管治疗中可以及时恢复体液和电解质平衡、呼吸支持和早期清创，但充分处理伤口本身对于改善患者预后至关重要。适当覆盖伤口不仅可以减少液体流失，还可以降低随后感染的风险；自体皮肤移植被认为是这些伤口的标准护理治疗，因为它提供了快速的覆盖和改善伤口愈合。然而，大面积烫伤的患者缺乏足够的健康皮肤进行移植，对于这些人来说，治疗替代品是有利的。当无法进行自体移植时，带有真皮基质的皮肤替代物可作为大面积创伤的治疗选择。这些皮肤替代物可能是无细胞的或含有分化细胞，通常是自体角质形成细胞和成纤维细胞。尽管这种方法已经取得了成功，但自体细胞的培养非常耗时，异体成纤维细胞或角质形成细胞在放置后不久可能会被排斥。另一方面，采用生物活性物质分泌细胞支架进行治疗时，要求细胞与毛细血管间距在300～400μm以内，以保证支架内装载的细胞存活并完全发挥功能。然而，在烫伤创伤治疗中很难满足此条件的植入部位，其它各种可能的适合植入的部位又都无法达到预期的理想效果，这就导致植入的支架只能部分贴附在人体自身毛细血管表面，而另外未贴附毛细血管的部分由于氧气、营养物质等浓度较低，无法及时交换，致使装载的细胞不能发挥正常功能、存活率降低甚至死亡，产品的持效性较低。

3、这就急需一种新的基质来作为体外细胞的载体，解决目前伤口敷料中细胞存活的关键问题，实现烫伤等创面治疗，免除患者由于传统敷料反复更换和干细胞注射治疗带来的精神、肉体负担。

技术实现思路

1、脐血单核细胞(cordbloodmononuclearcell，cb-mnc)已被研究作为烫伤创面的治疗替代物。在过去几年中，在实验模型和人类中，脐血单核细胞已被有效地用于治疗多种疾病，如血液和免疫介导疾病、心脏功能障碍、骨损伤和皮肤溃疡。脐血单核细胞被认为适合于治疗皮肤溃疡和烫伤创面，不仅因为它们能够产生不同类型的细胞，还因为它们的旁分泌潜能、分泌细胞因子(tgf-b、il-10、il-6)、趋化因子(ccl2、ccl5、cxcl12)和生长因子(vegf、igf、bfgf、sdf、hgf)，这可能有助于愈合过程。脐血单核细胞的另一个有趣特性是免疫调节，它可能直接或间接影响免疫系统的不同组成部分，从而控制炎症。此外，脐血单核细胞几乎没有免疫原性，因此可以使用现成的同种异体细胞，研究指出沿着溃疡周围注射绿色荧光蛋白标记的cb-mnc能够加速上皮化，促进血管生成，并增加血管和内皮生长因子的表达。研究还发现脐血单核细胞可以成功治愈实验模型和患者的急性和慢性伤口。最近的研究表明，cb-mnc治疗可以促进大鼠和猪烫伤的愈合；此外，cb-mnc促进血管生成并加速肉芽组织的发育。脐血单核细胞也被证明对常规治疗无效的烫伤患者有效。rasulov在临床治疗中验证反复局部应用自体脐血单核细胞能够促进伤口愈合，并使烫伤患者的血浆水平正常化，临床和实验支持使用自体和异体脐血单核细胞治疗烫伤创面。采用脐血单核细胞治疗同种和异种烫伤创面时，脐血单核细胞扩增需要较长时间，自体细胞可能无法立即用于治疗；基于脐血单核细胞呈现mhc分子的低表达，可使同种和异种应用成为可能，因此，来自健康供体的异基因脐血单核细胞，可能是广泛烫伤患者初期和急性护理的更合适的替代方案。

2、综合上述脐血单核细胞在创伤治疗中的优势和利用脐血单核细胞治疗同种和异种烫伤创面中存在的制约因素，本研究团队通过制备、筛选出生物安全性好的水凝胶，进一步将成纤维细胞和脐血单核细胞分别与水凝胶(nocc/a-ha)共培养，发现本研究中水凝胶共培养存活细胞的存活率得到大幅度提升；同时研究也证实本发明的水凝胶(nocc/a-ha)可以防止伤口组织受损时发生的组织粘连，并提高伤口愈合的效率；在体外小鼠烫伤模型治疗实验中，负载脐血单核细胞的水凝胶复合物对小鼠烫伤创伤的愈合更快，愈后无疤痕，治疗21天后，观察到伤口完全闭合，同时该治疗小鼠的毛发在伤口区的再生比其他组更明显；新皮肤与周围皮肤无明显差异；

3、根据水凝胶(nocc/a-ha)共培养细胞的数据，完成了本发明。

4、第一方面，本发明提供一种水凝胶复合物，所述水凝胶复合物包括羧甲基壳聚糖、醛透明质酸和细胞，羧甲基壳聚糖和醛透明质酸通过席夫碱反应形成水凝胶，其中羧甲基壳聚糖和醛透明质酸的体积比为1-10:1；所述醛透明质酸由透明质酸通过官能团醛基化修饰获得，所述透明质酸选自天然透明质酸或者人工合成透明质酸；

5、进一步的，所述细胞选自成纤维细胞、肌细胞、上皮细胞、粘膜细胞和/或干细胞等；

6、更进一步的，所述干细胞选自脐带干细胞、亚全能干细胞、神经干细胞、脐带间充质干细胞、肝干细胞、心肌干细胞、血管内皮祖细胞、表皮成纤维干细胞和软骨干细胞中的一种或多种；

7、进一步的，所述羧甲基壳聚糖和醛透明质酸的体积比优选为2:1、4:1、6:1或8:1；

8、进一步的，所述水凝胶复合物还包括dmem、mem、rpmi1640、胎牛血清(fbs)、成牛血清(abs)、牛血清白蛋白(bsa)、pbs、平衡盐溶液(bss)等中的一种或多种培养液。

9、第二方面，本发明提供一种含有水凝胶的细胞培养基，所述细胞培养基含有羧甲基壳聚糖、醛透明质酸和细胞培养液，羧甲基壳聚糖和醛透明质酸通过席夫碱反应形成水凝胶，其中羧甲基壳聚糖和醛透明质酸的体积比为1-10:1；所述醛透明质酸由透明质酸通过官能团醛基化修饰获得，所述透明质酸选自天然透明质酸或者人工合成透明质酸；

10、进一步，所述培养液选自dmem、mem、rpmi1640、胎牛血清(fbs)、成牛血清(abs)、牛血清白蛋白(bsa)、pbs、平衡盐溶液(bss)等中的一种或多种。

11、第三方面，本发明提供一种水凝胶复合物在制备皮肤创伤物质中的用途。

12、进一步的，所述水凝胶复合物包括羧甲基壳聚糖、醛透明质酸和细胞，羧甲基壳聚糖和醛透明质酸通过席夫碱反应形成水凝胶，其中羧甲基壳聚糖和醛透明质酸的体积比选自1-10:1；所述醛透明质酸由透明质酸通过官能团醛基化修饰获得，所述透明质酸选自天然透明质酸或者人工合成透明质酸；

13、进一步的，所述水凝胶复合物还包括dmem、mem、rpmi1640、胎牛血清(fbs)、成牛血清(abs)、牛血清白蛋白(bsa)、pbs、平衡盐溶液(bss)等的一种或多种培养液。

14、进一步的，所述创伤是指烧伤、机械损伤或炎症导致的皮肤或粘膜的创伤，所述粘膜包括口腔粘膜或鼻黏膜等。

15、进一步，所述修复创伤的物质可以是药物或医疗器械。

16、第四方面，本发明提供一种制备水凝胶复合物的方法，所述制备方法包括如下步骤：

17、s01醛透明质酸的合成：透明质酸钠进行醛基化修饰；

18、s02水凝胶复合物合成：先将需要的细胞培养液注入灭菌后的醛透明质酸溶液中，再将细胞注入含有细胞培养液的醛透明质酸溶液中，最后按比例加入羧甲基壳聚糖，形成水凝胶复合物。

19、进一步的，所述羧甲基壳聚糖和醛透明质酸的比例为1-10:1。

20、第五方面，本发明提供一种含有水凝胶的培养基的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

21、s01醛透明质酸的合成：透明质酸钠进行醛基化修饰；

22、s02水凝胶合成：将细胞培养液注入灭菌后的醛透明质酸溶液中，再按比例加入羧甲基壳聚糖，其中羧甲基壳聚糖和醛透明质酸的比例选自1-10:1，最终形成水凝胶培养基。

23、进一步的，所述细胞培养液包括dmem、mem、rpmi1640、胎牛血清(fbs)、成牛血清(abs)、牛血清白蛋白(bsa)、pbs、平衡盐溶液(bss)等中的一种或多种。