用于用放射性卤素对蛋白质进行位点特异性标记的试剂，以及制备和使用其的方法

发明领域总体而言，在本文中所公开的主题涉及在体内稳定的经位点选择性地放射性标记的生物学分子。

背景技术：

0、发明背景

1、许多生物分子选择性地和特异性地靶向细胞生物标志物的能力长期以来已被利用用于分子成像(例如，正电子发射断层成象术，“pet”)和靶向放射疗法，其中用放射活性原子对生物分子进行标记以选择性地递送至癌细胞，目的是杀死它们。这项开发利用使用放射活性有效负载与生物分子的连接。用于该目的的最佳放射性核素中的一些为放射性卤素。例如，18f用于pet成像，131i用于β-离子疗法，和211at用于α-粒子疗法。

2、在肽和蛋白质的情况下，经放射性标记的分子典型地通过将反应性双官能探针连接至在生物分子内的氨基酸(最经常赖氨酸)来制备。虽然用小肽(其很少具有超过一个或两个拷贝的每种氨基酸)来控制该缀合的位点是相当容易的，但是这对于较大的生物分子变成了一个大得多的问题。例如，大多数抗体包含在整个其大分子结构上分布的几十个赖氨酸。放射活性分子或者将会在随后步骤中被标记的前体分子与这些赖氨酸的不加区别的附接可以导致形成数千种不同的蛋白质缀合物，它们在被修饰的赖氨酸的位置和/或在独个蛋白质中的被修饰的不同赖氨酸的数目方面不同。不令人惊讶地，该所谓的用于生物缀合的“随机”方法具有低的再现性并且产生高度异质的缀合物群体。另外，该策略可以导致被无意地嫁接至在生物分子中的生物活性位点的有效负载，从而使得一部分缀合物不起作用。

3、为了避开这些问题，研究者们已将其注意力转向允许对于连接反应的位点的更好控制的策略，其被称为“位点特异性”生物缀合。用携带马来酰亚胺的探针缀合至半胱氨酸(在蛋白质中以小数目存在的携带巯基的氨基酸)已成为该领域的主要内容，并且在过去三十年中已被广泛使用。该策略的流行主要植根于其简单性和效率。许多蛋白质包含可以容易地被还原以形成反应性巯基的二硫桥，或者可以通过使用标准重组技术向蛋白质添加游离的半胱氨酸。然后，可以在生理ph和室温下进行在马来酰亚胺和硫氢基基团之间的迈克尔加成，从而可靠地在一小时内导致琥珀酰亚胺基硫醚连接的形成(参见图1)。

4、虽然在硫醇和马来酰亚胺之间的连接代表了不可否认的相对于随机缀合方法而言的改进，但是反应也遭受缺点之苦。事实上，基于马来酰亚胺的缀合物展示出有限的在生理介质中的稳定性，因为所述缀合物可以经历逆迈克尔反应，其导致有效负载的释放或者它通过转硫醇作用而转移至其他包含游离巯基的内源分子(最经常的是血清白蛋白、半胱氨酸和谷胱甘肽)。在核成像和放射疗法的情景下，该逆迈克尔反应可以导致放射活性有效负载的释放和内源生物分子通过巯基交换反应的体内放射性标记(参见图1)。这种“泄漏”引起在非靶组织中的更高摄取和同时在靶组织中的更低摄取，最终导致对健康组织的更高辐射剂量、降低的成像对比和更低的靶组织与正常组织辐射剂量比，和因此减小的治疗效力。

5、因此，将会希望的是创建这样的方法，其通过使用在所希望的靶位点处所经历的生理条件下是选择性的且稳定的连接策略来在蛋白质上的特定位点处对蛋白质进行放射性标记。

6、上面的讨论仅为了一般性背景信息而提供，并且不意欲用作在确定所要求保护的主题的范围中的帮助。

技术实现思路

0、发明概述

1、本公开内容提供了新型的用于放射性卤化的前体、用于制备经放射性卤化的辅成试剂(prosthetic agent)的过程和用于使用经放射性卤化的辅成试剂来制备经放射性标记的蛋白质或肽的过程。

2、在一个实施方案中，经放射性卤化的辅成试剂或放射性卤化支持物前体具有结构(i)：

3、

4、其中：

5、a为1-6；b为1-6；c为1-6；

6、l1为-c(o)-或

7、l2为键或-(ch2)n-，其中n为1-6；

8、g为胍、具有一个或多个氨基甲酸酯保护基团的胍、po3h、so3h、po2-otbu、so2-otbu、精氨酸、膦酰基苯丙氨酸、磺基苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亲水碳水化合物部分或聚乙二醇(peg)链；

9、y为ch或n；

10、x为snr23、b(oh)2、bpin或放射性卤素；

11、r1为c1-6烷基；并且

12、每个r2独立地为c1-6烷基。

13、在一个实施方案中，经放射性卤化的辅成试剂或放射性卤化支持物前体具有结构(ii)：

14、

15、其中：

16、a为1-6；b为1-6；c为1-6；

17、l为-c(o)-或

18、x为snr23、b(oh)2、bpin或放射性卤素；

19、r1为c1-6烷基；

20、每个r2独立地为c1-6烷基；并且

21、每个r3独立地为氨基甲酸酯保护基团或h。

22、在一个实施方案中，经放射性卤化的辅成试剂或放射性卤化支持物前体具有结构(iii)：

23、

24、在一个实施方案中，经放射性卤化的辅成试剂或放射性卤化支持物前体具有结构(iv)：

25、

26、在本公开内容的一个实施方案中，在化合物(i)-(iv)中任一个中的r1为甲基、乙基或丙基。在本公开内容的一个实施方案中，在化合物(i)-(iv)中任一个中，a为1或2，b为2或3，并且c为1或2。在本公开内容的一个实施方案中，在化合物(i)-(iv)的放射性卤化支持物前体中任一个中的x为snr23、b(oh)2或bpin，其中r2为甲基、乙基或正丁基。在本公开内容的一个实施方案中，在化合物(i)-(iv)的经放射性卤化的辅成试剂中任一个中的x选自由18f、122i、123i、124i、125i、131i、75br、76br、77br、80mbr和211at组成的组。

27、在一个实施方案中，经放射性标记的蛋白质或肽包括一个或多个通过硫醚键与蛋白质或肽相偶联的经放射性卤化的辅成试剂，其中所述一个或多个经放射性卤化的辅成试剂-蛋白质/肽缀合物具有结构(v)，或者所述一个或多个经放射性卤化的辅成试剂-蛋白质/肽缀合物为结构(v)的在药学上可接受的盐：

28、

29、其中：

30、a为1-6；b为1-6；c为1-6；

31、l1为-c(o)-或

32、l2为键或-(ch2)n-，其中n为1-6；

33、g为胍、具有一个或多个氨基甲酸酯保护基团的胍、po3h、so3h、po2-otbu、so2-otbu、精氨酸、膦酰基苯丙氨酸、磺基苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亲水碳水化合物部分或聚乙二醇(peg)链；

34、y为ch或n；

35、x为放射性卤素；

36、r1为c1-6烷基；并且

37、pep为蛋白质或肽。

38、在一个实施方案中，经放射性标记的蛋白质/肽具有结构(vi)：

39、

40、其中:

41、a为1-6；b为1-6；c为1-6；

42、l为-c(o)-或

43、x为放射性卤素；

44、r1为c1-6烷基；

45、每个r3独立地为氨基甲酸酯保护基团或h；并且

46、pep为蛋白质或肽。

47、在一个实施方案中，经放射性标记的蛋白质/肽具有结构(vii)：

48、

49、                             

50、其中pep为蛋白质/肽。

51、在一个实施方案中，经放射性标记的蛋白质/肽具有结构(viii)：

52、

53、其中pep为蛋白质/肽。

54、在本公开内容的一个实施方案中，在化合物(v)-(viii)中任一个中的x选自由18f、122i、123i、124i、125i、131i、75br、76br、77br、80mbr和211at组成的组。在本公开内容的一个实施方案中，在化合物(v)-(viii)中任一个中的蛋白质/肽包含至少一个半胱氨酸残基，并且所述放射性标记物中的一个或多个通过所述半胱氨酸残基与所述蛋白质/肽相偶联。在本公开内容的一个实施方案中，所述蛋白质/肽包含c-末端甘氨酸-半胱氨酸尾，并且所述放射性标记物通过所述c-末端甘氨酸-半胱氨酸尾与所述蛋白质/肽相偶联。在另一个实施方案中，所述蛋白质/肽包含n-末端甘氨酸-半胱氨酸尾，并且所述放射性标记物通过所述n-末端甘氨酸-半胱氨酸尾与所述蛋白质/肽相偶联。所述蛋白质/肽可以为抗体，例如单结构域抗体片段。所述蛋白质/肽为肿瘤靶向性蛋白质/肽。

55、在一个实施方案中，在受试者中施行分子成像的方法包括向所述受试者施用有效量的化合物(v)-(viii)中任一个的经放射性标记的蛋白质/肽。

56、在一个实施方案中，在受试者中治疗癌症的方法包括向所述受试者施用有效量的化合物(v)-(viii)中任一个的经放射性标记的蛋白质/肽。

57、在一个实施方案中，用放射活性卤素对蛋白质或肽进行标记的方法包括：

58、(i)获得具有结构(ii)的化合物：

59、

60、其中：

61、a为1-6；b为1-6；c为1-6；

62、x为放射性卤素；

63、r1为c1-6烷基；

64、每个r3独立地为氨基甲酸酯保护基团或h；并且

65、l为c(o)或和

66、(ii)当r3为h时，使化合物(ii)与所述蛋白质或所述肽进行反应，或者当r3为氨基甲酸酯保护基团时，使化合物(ii)与所述肽进行反应。

67、在一个实施方案中，所述用放射活性卤素对蛋白质/肽进行标记的方法进一步包括在使所述化合物与所述蛋白质进行反应之前从所述化合物上去除氨基甲酸酯保护基团(例如，boc基团)。在一个实施方案中，所述蛋白质或肽为抗体片段，例如单结构域抗体片段。在一个实施方案中，所述蛋白质/肽为肿瘤靶向性蛋白质/肽。

68、在本公开内容的一个实施方案中，所述方法进一步包括通过向蛋白质/肽添加c-末端甘氨酸-半胱氨酸尾来修饰所述蛋白质/肽。示例性的甘氨酸-半胱氨酸尾具有结构gnc，其中n为2至10的整数。所述放射性卤素-或放射性卤素支持物前体-辅成试剂与所述甘氨酸-半胱氨酸尾的半胱氨酸残基进行反应以在所述辅成试剂和所述蛋白质/肽之间形成硫醚键。在另一个实施方案中，所述蛋白质/肽包含n-末端甘氨酸-半胱氨酸尾，并且所述放射性标记物通过所述n-末端甘氨酸-半胱氨酸尾与所述蛋白质/肽相偶联。

69、在一个实施方案中，通过该方法制备的经放射性标记的蛋白质/肽具有结构(vii)：

70、

71、其中pep为蛋白质/肽。

72、在一个实施方案中，通过该方法制备的经放射性标记的蛋白质/肽具有结构(viii)：

73、

74、其中pep为蛋白质/肽。