一种金银花纳米囊泡的制备方法及其应用与流程

本发明属于植物提取物，具体涉及一种金银花纳米囊泡的制备方法及其应用。

背景技术：

1、牙周炎是由局部失衡的牙菌斑生态系统引起的牙周支持组织的慢性炎症，若未能及时治疗可由牙龈向深层扩散到牙周膜、牙槽骨和牙骨质，其临床表现为牙龈出血、临床附着丧失、牙槽骨被吸收以及深牙周袋的形成，伴随着病症加重，牙齿会逐渐松动，甚至脱落。从全球整体情况来看，大约有11％的世界人口可能患有严重的牙周炎，影响到约7.43亿人。其中，慢性牙周炎的持续发展会导致牙龈肿胀，溃烂，甚至牙齿脱落，从而导致生活质量下降进而带来严重的心理负担。

2、目前，牙周炎始发期主要采用的治疗方式是龈上洁治、龈下刮治和根面平整等机械清创方式，可机械设备难以完全去除龈下生物膜和结石，因此无法有效控制炎症，另外，全身或局部应用抗生素虽有适度的辅助治疗作用，阻止牙周病原菌重新定植，但长期使用会有毒副作用，甚至产生抗药性，所以亟需更安全有效的产品来缓解牙周炎的发展。

3、金银花，又称“忍冬”，是一种具有悠久历史的常用中药。金银花性寒，味甘，入肺、心、胃经，具有清热解毒、抗炎、补虚疗风的功效，且现代研究证明，金银花中含有绿原酸、木犀草素苷等多种药理活性成分，对溶血性链球菌、金黄葡萄球菌等多种致病菌及上呼吸道感染致病病毒等有较强的抑制力，另外还可增强免疫力、抗早孕、护肝、抗肿瘤、消炎、解热、止血(凝血)、抑制肠道吸收胆固醇等，其临床用途非常广泛，可与其它药物配伍用于治疗呼吸道感染、菌痢、急性泌尿系统感染、高血压等40余种病症。

4、金银花所具有的良好抑菌、消炎的特性也使其成为制备改善口腔健康类产品的重要中药原料之一，如专利cn110151945a中提到了将含有金银花提取物的中药成分用于抗牙周炎的治疗中；专利cn102145077a中公开了一种含有金银花的急性牙周炎的口腔中药制剂。

5、上述的专利中均是直接对金银花进行提取，并将提取获得的金银花中主要活性成分作为相应功效产品的原料之一，但由于金银花中主要的活性成分如绿原酸，其是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中含有酯键、不饱和双键及多元酚等三个不稳定的部分，在常规的提取过程中，若是提取温度较高，往往会因为水解和分子内酯基迁移而发生异构化，造成活性成分的损失，若是提取温度较低，则绿原酸由于溶解性较小使得提取率较低。

6、近年来，诸多研究表明，与动物类似，植物也普遍具有分泌外泌体样纳米囊泡的能力，植物外泌体富含多类rna、蛋白、脂质及小分子，在植物发育等生理过程中提供必要的细胞间通讯，此外，外泌体还可能是植物自我保护的第一道防线，在抗感染、跨物种交流中发挥重要作用。金银花纳米囊泡作为一种植物来源的细胞纳米囊泡，可以通过内吞或者与靶细胞直接接触进行膜融合释放活性物质进入生物循环并参与跨界通讯，与传统药物相比，具有发挥作用快、易被吸收、稳定和安全的特殊性能。

7、如专利cn112425703a中即公开了将金银花、蒲公英等植物外泌体与其他辅料相配合制备成一种用于改善口腔健康的产品，然而该专利中仅是采用了传统的差速离心法来获取所需的植物外泌体，事实上，采用传统方法获得的植物外泌体中蛋白及小rna的含量并不高，并且所获得的植物外泌体的稳定性较差，从而限制了其功效的发挥。

技术实现思路

1、为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种金银花纳米囊泡的制备方法及其在制备缓解牙周炎产品中的应用。

2、本发明所提供的一种金银花纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：

3、s1干金银花粉碎，加水混合均匀，获得金银花水溶液，采用纤维素酶和果胶酶对金银花水溶液进行酶解，获得金银花纳米囊泡酶解液；

4、s2采用差速离心法对s1中获得的金银花纳米囊泡酶解液进行处理，制得金银花纳米囊泡粗溶液；

5、s3采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾对s2中制得的金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰，然后经超滤、超高速离心，磷酸盐缓冲溶液重悬，制得金银花纳米囊泡。

6、上述的方法中，优选的，s1中，采用超微粉碎机对干金银花进行超微粉碎处理。

7、优选的，s1中，干金银花与水的质量体积比为1g：(1～10)ml，混合时长为1～2h，混合温度为20～30℃。

8、更为优选的，s1中，干金银花与水的质量体积比为1g：5ml，混合时长1h，混合温度为25℃。

9、本发明以金银花作为纳米囊泡的主要制备原料，而金银花中主要的活性成分为绿原酸与木犀草素苷，这两种成分的热稳定性均较差，且除了上述两种主要的活性成分之外，金银花纳米囊泡中还含有诸多蛋白质以及核酸小rna等成分，在较高的温度下这些成分均会因变性而失活，最终导致金银花纳米囊泡的活性受损甚至功能全部丧失。因此，本发明在整个金银花纳米囊泡的制备过程中均是于30℃以下的低温下进行操作，这一操作有利于更好地保持其中各种成分的生理活性，进而更好地发挥其功效。

10、优选的，s1中，所述的纤维素酶和果胶酶的重量之和占金银花水溶液重量的20～30％，纤维素酶与果胶酶的重量比为1：1～3，酶解的温度为20～30℃，酶解2～3h，使纤维素酶和果胶酶的最终占整体混合溶液重量的1～2.2％。

11、优选的，s1中，纤维素酶与果胶酶的重量比为1：1。

12、优选的，s2中，所述的差速离心法具体操作如下：将s1中获得的金银花纳米囊泡酶解液，先于500～800×g的离心力下离心10～20min，弃沉淀，获得第一次分离上清液；将获得的第一次分离上清液在1000～2500×g的离心力下离心20～40min，弃沉淀，获得第二次分离上清液；将所得第二次分离上清液在3000～5000×g的离心力下离心40～60min，弃沉淀，获得第三次分离上清液，制得金银花纳米囊泡粗溶液。

13、优选的，s3中，先将海藻糖酸钠与焦磷酸四钾溶于水制成复合溶液，复合溶液中，海藻糖酸钠与焦磷酸四钾的重量比为(1～3)：(1～3)，然后向s2中制得的金银花纳米囊泡粗溶液中加入海藻糖酸钠与焦磷酸四钾复合溶液并于0～20℃下修饰2～3h，其中，海藻糖酸钠与焦磷酸四钾复合溶液占金银花纳米囊泡粗溶液重量的10～20％，修饰结束后，海藻糖酸钠和焦磷酸四钾复合溶液占整体混合溶液重量分数的2～5％。

14、优选的，s3中采用海藻糖酸钠与焦磷酸四钾进行修饰时的温度为8～16℃。

15、本发明中采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的混合物对金银花纳米囊泡进行修饰后，所获得的金银花纳米囊泡中的活性成分稳定性显著提高。

16、优选的，s3中，超滤时所采用的超滤膜的孔径为0.25～0.45μm。

17、优选的，s3中，超滤后于4℃在120000～180000×g的离心力下离心0.5～2h，取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液进行重悬。

18、更为优选的，s3中，超滤后于4℃在150000×g的离心力下离心1h，取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液进行重悬。

19、除此之外，采用上述的方法所制备的金银花纳米囊泡，以及该金银花纳米囊泡在制备缓解牙周炎产品中的应用，也是本发明所要重点保护的内容，特别是，金银花纳米囊泡可以抑制由牙龈卟啉单胞菌分离得到的脂多糖(lps-pg)引起的人牙龈上皮细胞存活率下降的情况，有利于促进细胞增殖，此外其还可以有效抑制炎性因子的表达，减少骨吸收，保护牙周组织。

20、本发明的有益效果在于：

21、(1)提供了一种金银花纳米囊泡的制备方法，即先采用纤维素酶和果胶酶对温水处理后的金银花粉末进行处理后，利用差速离心法获得金银花纳米囊泡，最后采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的混合物对所获得的金银花纳米囊泡进行修饰，成功制得了粒径为146.3nm，zera电位为-8.25mv的金银花纳米囊泡，并且所获得的金银花纳米囊泡中蛋白质含量达6.98mg/ml，micrna的含量达163.55ng/μl，对于治疗牙周炎有显著效果；

22、(2)本发明中借助海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的特殊结构特点，采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的混合物对金银花纳米囊泡进行修饰，显著提高了金银花纳米囊泡的稳定性；这是因为海藻糖酸钠是一种纯天然的糖原，能够在外泌体表面形成独特的保护膜；焦磷酸四钾有助于提高海藻糖酸钠的保水性，从而起到低温分离时的抗冻裂作用，海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的协同修饰才能更好地减少分离和保存过程中纳米囊泡的损失，进而显著的提高了金银花纳米囊泡的稳定性；

23、并且，只有当海藻糖酸钠和焦磷酸四钾在一定的温度范围时，才能达到上述的效果，假若适当降低了海藻糖酸钠和焦磷酸四钾修饰时的温度，所获得的金银花纳米囊泡中蛋白及micrna的含量均有所下降。