一种多糖双层修饰脂质体及其制备与应用

本发明涉及多层脂质体，具体涉及一种多糖双层修饰脂质体及其制备与应用。

背景技术：

1、齐墩果酸(oa)是一种五环三萜化合物，由6个异戊二烯单元连接成5个闭环，已在水果、蔬菜和中草药等约1600多种植物中发现，具有治疗心血管疾病、糖尿病、癌症等功效。然而，oa的水溶性差、易氧化、在酸性或碱性环境中不稳定，导致其口服生物利用度低，限制了其在食品和药物中的广泛应用。

2、脂质体(liposome)是一种主要由磷脂组成、具有类细胞双分子层膜结构的囊泡，在水中磷脂分子亲水头部插入水相，疏水尾部向内聚集，直径在25～1000nm，可同时运载水溶性和脂溶性营养因子。将oa与脂质体结合可解决oa水溶性差的问题，拓宽其应用。如，中国专利cn106491535a设计的一种奥曲肽修饰金球壳纳米脂质体；其中的纳米脂质体就为齐墩果酸纳米脂质体。最终制得的奥曲肽修饰金球壳纳米脂质体可应用于治疗癌症。

3、但是，传统脂质体易受光、氧和胃肠消化酶的影响，且易被淋巴和网状内皮系统从血液中清除。当前的单一齐墩果酸脂质体在应用时通常存在还未进入靶向作用点就被清除的问题，影响其作用效果。

技术实现思路

1、本发明是为了克服现有技术中齐墩果酸脂质体易被清除的缺陷，提供了一种多糖双层修饰脂质体及其制备与应用以克服上述缺陷。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种多糖双层修饰脂质体，以齐墩果酸脂质体为核，在其表面依次包覆壳聚糖(chi)、聚半乳糖醛酸(pga)两种多糖，形成具有核壳结构的双层修饰齐墩果酸脂质体。

4、本技术的发明人针对当前单一的齐墩果酸脂质体易被清除的问题，设计在带负电的齐墩果酸脂质体上包覆带正电的壳聚糖层，再在壳聚糖层上包覆带负电的聚半乳糖醛酸层。整个复合脂质体的设计遵循静电吸附原理，将带正电的壳聚糖和带负电的聚半乳糖醛酸对带负电的齐墩果酸脂质体进行了层层自组装双层修饰。

5、双层脂质体的修饰，不仅能增强脂质体在储存过程中的稳定性，同时能够在胃部增强对oa的保护性，且在肠道中缓慢释放，提高生物利用率。同时，根据oa具有对α-异硫氰酸萘酯诱导的胆汁淤性肝损伤的作用与其同时激活nrf2信号通路(该通路是一个基本的信号级联，负责代谢，氧化应激，炎症和抗癌作用的抵抗)的护肝作用。并验证相比游离oa，壳聚糖和聚半乳糖醛酸双层修饰的齐墩果酸脂质体(pga-chi-oa脂质体)对急性肝损伤的修复有更显著的作用。

6、因而，可证实在齐墩果酸脂质体上进行壳聚糖层、聚半乳糖醛酸层的双层修饰后，齐墩果酸脂质体能得到有效且稳定的保护，从而增强应用效果。

7、优选地，所述多糖双层修饰脂质体的粒径大小均一，为280～320nm。

8、脂质体的粒径大小对于药物的分散性和生物利用度非常重要。较小的粒径通常更容易被细胞吸收，从而提升所包埋的功能成分的分散性和生物利用度。此外，较小的粒径和颗粒分散均一也有利于脂质体的稳定性提升。因此，在制备脂质体载体时，确保较小粒径且分散均匀的脂质体的是非常重要的。

9、一种多糖双层修饰脂质体的制备方法，包括以下步骤：

10、s1、将齐墩果酸、磷脂、pbs缓冲液混匀后二次均质得到齐墩果酸脂质体(oa脂质体)；

11、s2、将壳聚糖溶液与齐墩果酸脂质体混匀，得到壳聚糖包覆的齐墩果酸脂质体(ch-oa脂质体)；

12、s3、将s2中得到的壳聚糖包覆的齐墩果酸脂质体与聚半乳糖溶液混匀，得到聚半乳糖醛酸和壳聚糖双层修饰的齐墩果酸脂质体(pga-chi-oa脂质体)。

13、利用简单的溶液复配，两步混合后即可得到双层修饰的齐墩果酸脂质体，制备方法简便易于推广；并在oa与磷脂混合后进行了微射流处理，使得粒径均匀稳定，且能够增强包埋效果，减少被包埋物的释放，延长脂质体的货架期。

14、优选地，所述步骤s1中，齐墩果酸与磷脂的质量比为1：(6～10)。

15、进一步优选地，所述步骤s1中，齐墩果酸与磷脂的质量比为1：(8～10)。

16、进一步优选地，所述步骤s1中，齐墩果酸与磷脂的质量比为1：8。

17、齐墩果酸与磷脂的质量比影响到齐墩果酸脂质体的粒径，从而影响到以其为核的双层修饰后的脂质体粒径，而脂质体粒径将影响功能成分的吸收利用效果。本技术的发明人设计采用不同的齐墩果酸与磷脂的质量比来调控脂质体的粒径大小，保证所得脂质体更适宜应用。验证发现，当齐墩果酸与磷脂的质量比为1：(6～10)，所得双层修饰后的脂质体粒径均一，且粒径较小。且当1:8时，所得的脂质体尺寸较小，再增加磷脂用量对尺寸的改变影响甚微，考虑到磷脂成本，此处优选比为1:8。

18、优选地，所述步骤s1中，齐墩果酸以浓度1mg/ml的齐墩果酸溶液形式加入。

19、优选地，所述步骤s1中，磷脂以浓度60～100mg/ml的磷脂溶液形式加入。

20、为保证磷脂与齐墩果酸快速、均匀融合，可事先配制为溶液，以溶液形式互相混合。其中，溶液浓度的选择可根据实际需求进行调整，控制浓度的原因是为了控制引入的液体量，避免液体量过多影响整体的脂质体体系。

21、优选地，所述步骤s1中，齐墩果酸、磷脂、pbs缓冲液的混匀方式为：将齐墩果酸、磷脂、pbs缓冲液混合后加入乙醇，蒸干乙醇后再加入pbs缓冲液，混匀定容。

22、优选地，所述步骤s1中，二次均质的方式为：动态高压微射流1200～1500bar下进行两个循环处理。

23、进一步优选地，动态高压微射流压力为1500bar。

24、优选地，所述步骤s2中，壳聚糖溶液中溶质为壳聚糖、溶剂为冰醋酸溶液，壳聚糖溶液ph为3.5。

25、壳聚糖需要提前在酸性溶液中进行充分溶解。

26、优选地，所述方法中：

27、s1、将齐墩果酸、磷脂、100ml pbs缓冲液混匀后二次均质得到齐墩果酸脂质体；

28、s2、将0.05～0.1wt％壳聚糖溶液与齐墩果酸脂质体按体积比1：1混匀，得到壳聚糖包覆的齐墩果酸脂质体。

29、进一步优选地，所述壳聚糖溶液的浓度为0.1wt％。

30、壳聚糖的浓度将影响壳聚糖的加入量，而壳聚糖加入量的多少对脂质体的粒径有重要影响。当壳聚糖溶液的浓度为0.05～0.1wt％时，脂质体的平均粒径较小且较为稳定。

31、优选地，所述步骤s3中，聚半乳糖溶液中溶质为聚半乳糖、溶剂为pbs缓冲液。

32、优选地，所述方法中：

33、s1、将齐墩果酸、磷脂、100ml pbs缓冲液混匀后二次均质得到齐墩果酸脂质体；

34、s2、将0.05～0.1wt％壳聚糖溶液与齐墩果酸脂质体按体积比1：1混匀，得到包覆有壳聚糖层的齐墩果酸脂质体；

35、s3、将s2中得到的齐墩果酸脂质体与1～2mg/ml聚半乳糖溶液按体积比1：1混匀，得到壳聚糖和聚半乳糖醛酸双层修饰的齐墩果酸脂质体。

36、进一步优选地，所述聚半乳糖溶液的浓度为1～1.5mg/ml。

37、进一步优选地，所述聚半乳糖溶液的浓度为1.5mg/ml。

38、聚半乳糖的浓度将影响聚半乳糖的加入量，而聚半乳糖加入量的多少对脂质体的粒径有重要影响。当聚半乳糖溶液的浓度为1～2mg/ml时，脂质体的平均粒径较小且较为稳定。

39、优选地，所述步骤s3中，聚半乳糖醛酸和壳聚糖双层修饰的齐墩果酸脂质体溶液ph为6.5～7.5。

40、溶液ph接近人体ph，这种设计有助于确保脂质体在进入人体后能够与周围环境保持较好的相容性，并且有利于提高其在人体内的稳定性和生物利用度。

41、本发明还提供了上述多糖双层修饰脂质体或上述方法制得的多糖双层修饰脂质体可应用研究于预防或改善急性肝损伤。

42、通过建立急性肝损伤小鼠模型，获知多糖双层修饰脂质体对于急性肝损伤的修复有显著作用，有望应用于预防或改善急性肝损伤。

43、因此，本发明具有以下有益效果：

44、(1)所用多糖修饰物壳聚糖和聚半乳糖醛酸均为食品原料，成本较低、资源丰富，在一定条件下两者可通过正负电荷相互吸引层层修饰于脂质体表面，制备方法简单，形成的pga-chi-oa脂质体颗粒分散均匀，安全性、稳定性和生物利用率高，可应用于食品及保健品。

45、(2)pga-chi-oa脂质体可在胃酸中保持结构稳定、在小肠中修饰物脱落暴露出脂质体，随后脂质体经胰酶水解释放出包埋物，具有一定的小肠靶向释放能力，提高了被递送物质的生物利用效率。

46、(3)pga-chi-oa脂质体的功能特性明显，相较游离oa，通过动物实验表明该脂质体配方对急性肝损伤小鼠有较好的修复作用，应用前景广阔。