一种利用阳离子多聚物提升软骨中糖胺多糖含量的方法

本发明属于生物医用材料，具体涉及一种利用阳离子多聚物提升软骨中糖胺多糖含量的方法。

背景技术：

1、成人关节软骨再生能力有限，损伤后难以自发修复，发生骨关节炎等永久性损伤，带来疼痛和劳动力丧失，已影响我国上亿人口生活质量。目前关节软骨的胞外基质的完全再生仍是一大挑战。糖胺多糖的不可逆性丢失，就是骨关节炎的典型病理特征。胞外基质成分占透明软骨总重的95％，是其支撑、润滑作用的物质基础，其中有大量硫化的糖胺多糖为软骨制造负电荷微环境，可保护软骨细胞和保持组织水分的作用。然而，糖胺多糖在软骨病变中极易丢失，难以新生。例如，在机械损伤、炎症等状态下，关节表层糖胺多糖减少和纤维增生是骨关节炎早期的典型征兆。其进行性丢失造成关节软骨润滑和支撑能力下降。

2、目前，现有针对糖胺多糖丢失，有以下治疗方法：

3、1.口服或注射透明质酸、硫酸软骨素等糖胺多糖，用以补充软骨组织的糖胺多糖成分。此类方法可短期缓解骨关节炎症状，但效果备受争议，原因在于补充的糖胺多糖难以在关节腔长期驻留，并被软骨组织持续合成，无法有效阻止骨关节炎的进展。

4、2.利用含有糖胺多糖成分的仿生水凝胶，填补缺失的软骨组织，可物理性保护软骨表层，并为原位细胞提供和生理类似的微环境；但是仿生水凝胶无法完全模仿天然糖胺多糖复杂的结构和成分，一旦发生因无法有效吸引内源细胞参与再生糖胺多糖，易导致再生效果不完全；另外，糖胺多糖对细胞黏附和增殖的作用仍存在争议，对于大面积缺损的修复，存在组织整合欠佳的情况。

5、3.使用间充质干细胞对骨关节炎或软骨损伤进行治疗，其中涉及的方法包括：关节腔注射间充质干细胞、微骨折术(手术打穿软骨下骨，让软骨下骨髓腔中的骨髓间充质干细胞迁移至损伤进行修复)，间充质干细胞具有一定的软骨分化能力，难以完全再生透明(关节)软骨细胞，新生的纤维样软骨，会有糖胺多糖缺失并代偿增生异常胞外基质。如使用组织工程等方法，利用生长因子调控间充质干细胞的软骨分化，或生物支架负载细胞植入，可以一定程度改善修复效果，但仍伴有纤维样组织形成。

6、综上，现有方法尚不能有效解决软骨损伤和退变中，糖胺多糖无法完全再生的问题。主要原因包括1)补充的糖胺多糖难以有效驻留在关节表面；2)现有方法无法精确刺激细胞生成新糖胺多糖。

7、可见糖胺多糖对软骨功能十分重要，现有方法难以实现糖胺多糖有效再生，也就难以为软骨再生提供良好的微环境来促进软骨的修复，因此急需找到一种能实现软骨糖胺多糖形成的方法。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种利用阳离子多聚物提升软骨糖胺多糖含量的方法，通过采用含有聚凝胺的制剂处理软骨，促进软骨组织中的糖胺多糖含量明显升高，为软骨修复创造良好的微环境，促进软骨更好地修复再生；通过采用含有聚凝胺的诱导培养基培养间充质干细胞，能提高间充质干细胞分化组织中的糖胺多糖含量，促进间充质干细胞更好地进行软骨分化。

2、一方面，本发明提供了一种提升组织中糖胺多糖含量的方法，所述方法为采用含有聚凝胺的制剂处理该组织。

3、糖胺多糖也称黏多糖，是蛋白聚糖大分子中聚糖部分的总称，存在自然界许多物质当中，例如动物皮、动物软骨甚至人体肠胃道或呼吸道表层黏膜。糖胺多糖由糖胺的二糖重复单位组成，二糖单位中通常有一个是含氨基的糖，另一个常常是糖醛酸，并且糖基的羟基常常被硫酸酯化。糖胺多糖是软骨组织的重要成分，承担润滑、组织支撑和缓冲等作用。糖胺多糖在软骨病变中极易流失，流失后影响软骨组织功能，带来严重的社会影响。所以，需要针对促进软骨糖胺多糖再生，开发新的治疗手段。

4、糖胺聚糖可分为硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸、肝素及硫酸乙酰肝素等类别。糖胺多糖在组织中具有保护支撑等作用，并为细胞提供稳态微环境，是再生医学中的重要物质。软骨糖胺多糖的主要成分是硫酸软骨素和透明质酸，其中的硫酸软骨素是糖蛋白(蛋白聚糖，aggrecan(acan))的组成部分。

5、聚凝胺又名为溴化己二甲铵，是一种阳离子聚合物，最常见应用于病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞和病毒表面的静电排斥，细胞培养中主要用于提高逆转录病毒感染细胞的效率，通过中和细胞表面的唾液酸和病毒粒子之间的电荷排斥实现。聚凝胺在蛋白质测序中也有一定作用，还可高温高压灭菌，安全可控，价格便宜，方便应用。

6、由于阳离子聚合物带有正电荷，而糖胺多糖带有负电荷，因此本发明尝试采用阳离子聚合物处理受损的软骨组织，期望能有效改善软骨组织中的糖胺多糖浓度。

7、经过大量的研究实验，本发明发现，通过采用含有聚凝胺的制剂处理软骨组织，能有效提升软骨组织中的糖胺多糖含量，促进软骨修复再生，其原因可能是：聚凝胺带正电，糖胺多糖和细胞膜带负电，聚凝胺可能利用电荷吸引作用，吸附组织中的糖胺多糖，促进细胞和糖胺多糖的黏附整合，维持糖胺多糖的驻留；也有可能聚凝胺可有效增加间充质干细胞分化的软骨组织中的糖胺多糖含量，会促进糖胺多糖代谢增加，这方面还有待后续的深入研究证明。

8、进一步地，所述聚凝胺的结构式如式(1)所示：

9、

10、其中，n＝2000～8000。

11、在一些方式中，优选的，n＝4000～6000。

12、进一步地，所述制剂中，聚凝胺的浓度为5～100ug/ml；所述组织为软骨组织或类软骨组织。所述糖胺多糖包括硫酸软骨素、prg4、acan糖蛋白等。

13、在一些方式中，所述含有聚凝胺的制剂为光交联的水凝胶，可涂抹在软骨损伤表面，经紫外灯照射后进行光交联。

14、在一些方式中，所述聚凝胺的溶解方法为，称取相应粉末，预溶解于双蒸水中作为储存液，储存液中聚凝胺的浓度为10-100mg/ml。利用0.22μm孔径的无菌滤器过滤除菌，再将聚凝胺储存液添加于还未光交联的水凝胶溶液中，逐滴添加，边加边混匀，至聚凝胺在水凝胶溶液中的终浓度为5-100μg/ml(优选10-50μg/ml)。

15、在一些方式中，所述水凝胶溶液组成的组成优选但不限于以下：磷酸盐缓冲液作为溶剂(ph7.2)，20％(质量分数)的甲基丙烯酸明胶(gelatin-methacryloyl，以下简称gelma)，10％(质量分数)的n-(2-氨基乙基)-4-(4-(羟甲基)-2-甲氧基-5-亚硝基苯氧基)丁酰胺修饰的硫酸软骨素(chondroitin sulfate-n-(2-aminoethyl)-4-(4-(hydroxymethyl)-2-methoxy-5-nitrosophenoxy butanamide，简称cs-nb)，和0.25％(质量分数)的n-(2-氨基乙基)-4-(4-(羟甲基)-2-甲氧基-5-亚硝基苯氧基)丁酰胺修饰的透明质酸(hyaluronic acid-n-(2-aminoethyl)-4-(4-(hydroxymethyl)-2-methoxy-5-nitrosophenoxy butanamide，简称ha-nb)。所述溶液在使用前进行120℃，8分钟的灭菌处理。

16、在一些方式中，所述水凝胶溶液在光交联之前需加入光引发剂，光引发剂优选但不限于0.25％(质量分数)的苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate，简称lap)。紫外照射波长为405nm，照射时间为20～30秒。

17、在一些方式中，针对软骨的体外培养，可将骨关节炎患者软骨组织在无菌条件下切割为小软骨块(5mm×1cm×5mm)，培养于溶解有聚凝胺的无血清dmem/f12培养基(dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture f-12，gibico11320033)中，置于37℃，5％二氧化碳，其余为空气的环境中培养14-28天，每3天更换含有聚凝胺的新鲜培养基一次。

18、另一方面，本发明提供了一种用于软骨损伤修复的制剂，所述制剂中含有聚凝胺。

19、再一方面，本发明提供了一种促进间充质干细胞软骨分化的方法，所述方法为采用含有聚凝胺的培养基培养间充质干细胞。

20、间充质干细胞是来源于中胚层的一种具备自我更新、多向分化潜能的成体干细胞。因其体外规模化扩增仍能保持生物学特性，间充质干细胞被广泛应用于组织工程和再生医学中。在骨关节炎治疗和软骨损伤治疗中也常有应用。间充质干细胞具有软骨分化潜能，但是其分化的软骨表型和关节表面的透明软骨细胞存在差异，故临床治疗效果存在争议，常伴有纤维软骨形成。主要影响原因包括，微环境因素和间充质干细胞自身的分化潜能。

21、本发明提供的含有聚凝胺的培养基，能够为间充质干细胞提供更好的微环境，从而有助于间充质干细胞更好地分化为适于临床治疗的软骨，消除与天然软骨细胞的差异。

22、进一步地，所述培养基中聚凝胺的浓度为0.5～5ug/ml。

23、在一些方式中，对间充质干细胞进行平面诱导，采用人间充质干细胞常规贴壁培养至汇合度60-80％，更换溶解有聚凝胺的软骨分化诱导培养基，在37℃，3-8％二氧化碳，其余为空气的环境中培养，每3天更换溶解有聚凝胺的软骨分化诱导培养基一次，连续培养7-14天。

24、在一些方式中，对间充质干细胞进行三维类器官诱导，将间充质干细胞悬液收集于15ml无菌离心管中(1-3×105个细胞/管)，1200-1500rpm离心3-5分钟后，使细胞聚集于底部，弃上清，更换上溶解有聚凝胺的软骨分化诱导培养基，轻轻吹打细胞，使细胞与培养基充分接触，并室温静止5-15分钟。之后再次1200-1500rpm离心3-5分钟，使细胞沉于离心管底部。将无菌离心管松开管盖，置于37℃，5％二氧化碳，其余为空气的环境中培养21-28天，每3天更换新鲜的含有聚凝胺的软骨分化诱导培养基一次。

25、在一些方式中，所述聚凝胺的溶解方法为，称取相应质量的粉末，预溶解于双蒸水中作为储存液，储存液中聚凝胺的浓度为10-100mg/ml。利用0.22μm孔径的无菌滤器过滤除菌，再用软骨分化诱导培养基稀释聚凝胺储存液，至聚凝胺终浓度为0.5-5μg/ml。

26、在一些方式中，所述软骨分化诱导培养基的组成为h-dmem培养基(high glucosedulbecco's modified eagle medium，gibico11965118)作为溶剂，并在此基础上按以下形式加入其余成分：单独添加1％胰岛素硒铁传递蛋白乙醇胺(insulin，transferrin，selenium，ethanolamine solution，简称its，gibico51500056)，ph值自然；单独添加2.5-10ng/ml重组人转化生长因子β3(recombinant human tgfβ3，简称tgfβ3，peprotech100-36e)，ph值自然；合并添加1％ its，以及2.5-10ng/mltgfβ3，ph值自然；优选，添加1％丙酮酸钠(sodium pyruvate 100mm solution，gibico11360070)，50μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸盐水合物(sigma a8960)，10-7m地塞米松(sigmad4902)；1％ its，和10ng/ml tgfβ3，有助于促进软骨分化的效果，ph值自然。

27、在一些方式中，所述软骨分化诱导培养基的组成为h-dmem培养基(high glucosedulbecco's modified eagle medium，gibico11965118)作为溶剂，添加1％丙酮酸钠(sodium pyruvate 100mm solution，gibico11360070)，50μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸盐水合物(sigma a8960)，10-7m地塞米松(sigmad4902)；1％its，和10ng/ml tgfβ3，ph值自然。

28、所述间充质干细胞可以为骨髓来源或脂肪来源。间充质干细胞也可以更换为骨关节炎患者软骨组织来源的软骨细胞。

29、再一方面，本发明提供了一种用于诱导间充质干细胞软骨分化的培养基，所述培养基中含有聚凝胺。

30、再一方面，本发明提供了聚凝胺用于制备促进提升组织中糖胺多糖含量的制剂的用途。

31、再一方面，本发明提供了聚凝胺用于制备促进软骨再生的制剂的用途。

32、本发明提供的含有聚凝胺的制剂能够促进软骨完全再生，也能诱导间充质干细胞分化成更适于临床治疗的软骨，帮助实现软骨完全再生。

33、完全再生是指机体通过修复过程，完全回复原有的组织/细胞的结构和功能，和“不完全再生”相对应，后者无法完全复现原有的组织/细胞，经常会产生瘢痕纤维组织。现有的其他方法由于无法维持软骨组织中的糖胺多糖含量，因此难以做到使软骨完全再生。通过本发明提供的方法，能显著提供软骨组织中的糖胺多糖含量，从而有效维持软骨修复所需的微环境，帮助软骨实现完全再生。

34、再一方面，本发明提供了聚凝胺用于制备促进间充质干细胞向软骨分化的制剂的用途。

35、本发明提供的技术方案具有以下有益效果：

36、1、发现聚凝胺能够有效提升软骨组织中的糖胺多糖含量，提供一个适于软骨再生的微环境；

37、2、采用含有聚凝胺的诱导培养基培养间充质干细胞，能提高间充质干细胞分化组织中的糖胺多糖含量，促进间充质干细胞更好地进行软骨分化；

38、3、采用含有聚凝胺的制剂处理软骨，促进软骨更好地修复再生。