单链可变片段（scFv）修饰的脂质纳米颗粒组合物及其用途的制作方法

背景技术：

1、可离子化脂质纳米颗粒(lnp)已广泛用于rna治疗剂的全身递送。先前已经报道了用于lnp配制物的各种类型的可离子化脂质材料，诸如c12-200、ckk-e12和dlin-mc3-dma，并且已经证明了在0.002mg sirna/kg的剂量水平下在肝中的有效基因沉默(dong等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.111,3955–3960(2014))。尽管已经显示包含靶向配体增强mrna–lnp的递送和治疗效率，但是已经认识到，附接靶向部分可能增加制造lnp系统的过程的复杂性、成本和调节难度(cheng等人，science.2012年11月16日；338(6109):903-10)。另外，已经证明，当脂质纳米颗粒暴露于生物流体时(其中发生与介质中的蛋白质相互作用并因此形成蛋白质冠)，一些靶向配体的靶向特异性可能消失(salvati等人，natnanotechnol.2013年2月；8(2):137-43)。因此，在可能的临床益处与靶向rna-lnp制造的复杂性和成本之间存在权衡。

2、抗体通过靶向仅在患病细胞的表面上表达或相对于健康细胞在这些细胞上过表达的特定抗原而起作用。由于这些抗原单独地或大量地存在于靶标患病细胞的表面上，因此抗体可以在概念上被利用来携带纳米颗粒及其货物(例如，治疗剂)通过身体并且使得能够选择性递送/靶向。虽然这种方法是在20世纪80年代首次探索的，但是存在相当大的限制，诸如用于产生和评价抗体装饰的纳米颗粒的方法不充分，这阻止了该领域中的显著进展。在过去的几十年中，抗体表达技术和纳米颗粒设计的进步使得能够更彻底地探索纳米颗粒-抗体缀合物，这导致了该领域的快速扩展。早期开发几乎完全集中于使用完整抗体作为靶向配体，这主要是由于关于它们的产生和修饰的大量可获得信息。然而，出现了与使用完全抗体配体相关的几个问题，诸如免疫原性、快速消除、稳定性差以及低于预期功效。

3、抗体的模块性质在结构上和功能上允许通过分子克隆、抗体工程和甚至酶促方法产生较小的抗原结合片段，诸如抗原结合片段(fab)、单链可变片段(scfv)、单结构域抗体和可结晶片段(fc)结构域。抗体的抗原结合片段具有相当大的潜力来克服常规mab的缺点，诸如对实体瘤的不良渗透和fc介导的免疫系统的旁观者活化。抗体片段可单独使用或与其他分子连接以产生双特异性、多特异性、多聚体或多功能分子的多种可能性，以及实现多种生物效应。抗体片段可提供优于使用常规抗体的若干优点。例如，它们可以容易地生产，通常使用微生物表达系统，这导致较快的培养、较高的产量和较低的生产成本(fernandesjc,drug discov today.2018年12月；23(12):1996-2002)。它们的小尺寸允许接近具有挑战性的隐蔽表位和肿瘤穿透，它们具有降低的免疫原性，并且fc的缺乏限制了免疫系统的旁观者活化(kholodenko等人.curr med chem.2019；26(3):396-426)。另一方面，它们的较小尺寸导致较快的肾排泄，这可能需要较高的剂量和/或较频繁的体内给药方案。

4、尽管已经显示lnp对于体内递送是有利的，但是全身递送rna治疗剂而非递送到肝脏肝细胞仍然是高度挑战性的。这些lnp的相对大的尺寸通过几种机制降低了肝脏适应症的治疗指数：(1)较大的lnp不能有效地绕过衬在肝窦状隙中的内皮细胞的窗孔，从而阻止进入靶细胞(肝细胞)；(2)较大的lnp不能经由网格蛋白介导的与几种不同受体(例如，脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)、低密度脂蛋白(ldl)受体)的胞吞作用被肝细胞有效地内化；以及(3)高于某一阈值大小的lnp倾向于被网状内皮系统的细胞优先摄取，这可以激发剂量限制性免疫应答。尽管有这些进展，但lnp介导的较大刚性多核苷酸货物(例如，双链线性dna、质粒dna、末端封闭的双链dna(cedna)的递送相对于较小和/或柔性货物(例如，sirna)存在另外的挑战。此类挑战涉及当包封大的刚性货物时所得lnp的尺寸。

5、为了完全实现lnp靶向的核酸治疗剂的潜力，需要有效的体内递送系统。

技术实现思路

1、本公开提供了一种药物组合物，其包含脂质纳米颗粒(lnp)、治疗性核酸(tna)和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中lnp包含与lnp连接的单链可变片段(scfv)，并且其中scfv针对存在于细胞(例如，肿瘤细胞)表面上的抗原。本文所述的lnp组合物有利地提供有效的共价缀合，其中对粒度和稳定性的影响极小。本公开的发现是scfv与lnp的马来酰亚胺缀合连同其他基于硫醇的交联方法一起导致与lnp的稳固缀合，并且重要地是，维持lnp大小和完整性。

2、根据第一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含脂质纳米颗粒(lnp)、治疗性核酸(tna)和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中lnp包含与lnp连接的单链可变片段(scfv)，并且其中scfv针对存在于细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，scfv与lnp共价连接。在一些实施方案中，scfv与lnp化学缀合。在一些实施方案中，scfv通过不可切割的接头与lnp化学缀合。在一些实施方案中，不可切割的接头为含马来酰亚胺的接头。在一些实施方案中，scfv通过可切割的接头与lnp化学缀合。在一些实施方案中，可切割的接头为含有吡啶基二硫化物(pds)的接头。在一些实施方案中，scfv通过转谷氨酰胺酶介导的缀合与lnp连接。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，抗原为肿瘤相关抗原(taa)或肿瘤特异性抗原(tsa)。在另一实施方案中，抗原为人表皮生长因子受体2(her2)。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，scfv为二价的。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，lnp能够被内化到细胞中。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，scfv包含seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2中所示的氨基酸序列具有至少99％的序列相似性。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，scfv包含seq id no:3的氨基酸序列或与seq id no:3中所示的氨基酸序列具有至少99％的序列相似性。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，lnp包含选自由以下组成的组的脂质：阳离子脂质、甾醇或其衍生物、非阳离子脂质和peg化脂质。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，tna被包封在lnp中。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，tna选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、反义寡核苷酸(aso)、核酶、末端封闭的(cedna)、迷你串、doggybonetm、末端经前端粒封闭的dna或哑铃线性dna、切丁酶-底物dsrna、小发夹rna(shrna)、非对称干扰rna(airna)、微rna(mirna)、mrna、trna、rrna、dna病毒载体、病毒rna载体、非病毒载体以及它们的任何组合。在一些实施方案中，tna为cedna。在一些实施方案中，cedna为线性双链体dna。在一些实施方案中，tna为mrna。在一些实施方案中，tna为sirna。在一些实施方案中，tna为质粒。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，将药物组合物施用于受试者。在一些实施方案中，受试者为需要用包封有tna的lnp治疗的人类患者。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，组合物靶向表达scfv所针对的细胞表面抗原的细胞。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，组合物靶向肿瘤细胞。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，组合物靶向肝脏细胞。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，组合物靶向肝脏中的肝细胞。

3、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质由式(i)表示：

4、

5、或其药学上可接受的盐，其中：

6、r1和r1'各自独立地为任选取代的直链或支链c1-3亚烷基；

7、r2和r2'各自独立地为任选取代的直链或支链c1-6亚烷基；

8、r3和r3'各自独立地为任选取代的直链或支链c1-6烷基；

9、或者另选地，当r2是任选取代的支链c1-6亚烷基时，r2和r3与它们的居间n原子一起形成4元至8元杂环基；

10、或者另选地，当r2'是任选取代的支链c1-6亚烷基时，r2'和r3'与它们的居间n原子一起形成4元至8元杂环基；

11、r4和r4’各自独立地为-cra、-c(ra)2cra或-[c(ra)2]2cra；

12、ra每次出现时独立地为h或c1-3烷基；

13、或者另选地，当r4为-c(ra)2cra或-[c(ra)2]2cra并且当ra为c1-3烷基时，r3和r4与它们的居间n原子形成4元至8元杂环基；

14、或者另选地，当r4'为-c(ra)2cra或-[c(ra)2]2cra并且当ra为c1-3烷基时，r3'和r4'与它们的居间n原子一起形成4元至8元杂环基；

15、r5和r5'各自独立地为氢、c1-20亚烷基或c2-20亚烯基；

16、r6和r6'每次出现时独立地为c1-20亚烷基、c3-20亚环烷基或c2-20亚烯基；并且

17、m和n各自独立地为选自1、2、3、4和5的整数。

18、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质由式(ii)表示：

19、

20、或其药学上可接受的盐，其中：

21、a为1至20范围内的整数；

22、b为2至10范围内的整数；

23、r1不存在或选自(c2-c20)烯基、-c(o)o(c2-c20)烷基和被(c2-c20)烷基取代的环丙基；并且

24、r2为(c2-c20)烷基。

25、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，脂质由式(v)表示：

26、

27、或其药学上可接受的盐，其中：

28、r1和r1'各自独立地为任选地被一个或多个选自ra的基团取代的(c1-c6)亚烷基；

29、r2和r2'各自独立地为(c1-c2)亚烷基；

30、r3和r3’各自独立地为任选地被一个或多个选自rb的基团取代的(c1-c6)烷基；

31、或者另选地，r2和r3和/或r2'和r3'与它们的居间n原子一起形成4元至7元杂环基；

32、r4和r4'各自为被-c(o)o-中断的(c2-c6)亚烷基；

33、r5和r5'各自独立地为(c2-c30)烷基或(c2-c30)烯基，它们各自任选地被-c(o)o-或(c3-c6)环烷基中断；并且

34、ra和rb各自为卤素或氰基。

35、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质由式(xv)表示：

36、

37、或其药学上可接受的盐，其中：

38、r'不存在，为氢或c1-c6烷基；前提条件是当r'为氢或c1-c6烷基时，r'、r1和r2所附接到的氮原子均被质子化；

39、r1和r2各自独立地为氢、c1-c6烷基或c2-c6烯基；

40、r3为c1-c12亚烷基或c2-c12亚烯基；

41、r4为c1-c16非支链烷基、c2-c16非支链烯基，或其中：

42、r4a和r4b各自独立地为c1-c16非支链烷基或c2-c16非支链烯基；

43、r5不存在，为c1-c8亚烷基或c2-c8亚烯基；

44、r6a和r6b各自独立地为c7-c16烷基或c7-c16烯基；前提条件是r6a和r6b组合中的碳原子总数大于15；

45、x1和x2各自独立地为-oc(＝o)-、-sc(＝o)-、-oc(＝s)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)s-、-s-s-、-c(ra)＝n-、-n＝c(ra)-、-c(ra)＝no-、-o-n＝c(ra)-、-c(＝o)nra-、-nrac(＝o)-、-nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)o-、-osi(ra)2o-、-c(＝o)(cra2)c(＝o)o-或oc(＝o)(cra2)c(＝o)-；其中：

46、ra每次出现时独立地为氢或c1-6烷基；并且

47、n是选自1、2、3、4、5和6的整数。

48、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质由式(xx)表示：

49、

50、或其药学上可接受的盐，其中：

51、r'不存在，为氢或c1-c3烷基；前提条件是当r'为氢或c1-c3烷基时，r'、r1和r2所附接到的氮原子均被质子化；

52、r1和r2各自独立地为氢或c1-c3烷基；

53、r3为c3-c10亚烷基或c3-c10亚烯基；

54、r4为c1-c16非支链烷基、c2-c16非支链烯基，或其中：

55、r4a和r4b各自独立地为c1-c16非支链烷基或c2-c16非支链烯基；

56、r5不存在，为c1-c6亚烷基或c2-c6亚烯基；

57、r6a和r6b各自独立地为c7-c14烷基或c7-c14烯基；

58、x为-oc(＝o)-、-sc(＝o)-、-oc(＝s)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)s-、-s-s-、-c(ra)＝n-、-n＝c(ra)-、-c(ra)＝no-、-o-n＝c(ra)-、-c(＝o)nra-、-nrac(＝o)-、-nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)o-、-osi(ra)2o-、-c(＝o)(cra2)c(＝o)o-或oc(＝o)(cra2)c(＝o)-；其中：

59、ra每次出现时独立地为氢或c1-6烷基；并且

60、n是选自1、2、3、4、5和6的整数。

61、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质选自表2、表5、表6、表7或表8中的任何脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质为具有以下结构的脂质：

62、

63、或其药学上可接受的盐。

64、在一些实施方案中，阳离子脂质为具有以下结构的mc3(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma或mc3)：

65、

66、或其药学上可接受的盐。

67、在上述任何方面和实施方案的一些实施方案中，甾醇或其衍生物为胆固醇或β-谷甾醇。在一些实施方案中，非阳离子脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺(dspe)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰基磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(dope-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆酰基磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰基磷脂酰基-乙醇胺(dspe)、单甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-o-单甲基pe)、二甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-o-二甲基pe)、18-1-反式pe、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(sope)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、卵磷脂酰胆碱(epc)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)、鞘磷脂(sm)、二肉豆酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、二肉豆酰基磷脂酰甘油(dmpg)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(dspg)、二芥酰基磷脂酰胆碱(depc)、棕榈酰基油酰磷脂酰甘油(popg)、二反式油酰基磷脂酰乙醇胺(depe)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dlpe)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dphype)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(esm)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱以及它们的混合物。在一些实施方案中，非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二硬脂基酰磷脂酰胆碱(dspc)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)。在一些实施方案中，peg化脂质选自由以下组成的组：peg-二月桂基氧基丙基；peg-二肉豆蔻基氧基丙基；peg-二棕榈基氧基丙基、peg-二硬脂基氧基丙基；l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(dmg-peg)；peg-二月桂基甘油；peg-二棕榈酰甘油；peg-二硬脂酰甘油；peg-二月桂酰糖酰胺；peg-二肉豆蔻酰糖酰胺；peg-二棕榈酰糖酰胺；peg-二硬脂酰糖酰胺；(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧辛酰基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)(peg-胆固醇)；3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚(peg-dmb)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n[甲氧基(聚乙二醇)(dspe-peg)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-聚(乙二醇)-羟基(dspe-peg-oh)。在一些实施方案中，peg化脂质为dmg-peg、dspe-peg、dspe-peg-oh或它们的组合。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，该至少一种peg化脂质为dmg-peg2000、dspe-peg2000、dspe-peg2000-oh、dmg-peg5000、dspe-peg5000、dspe-peg5000-oh或它们的组合。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，scfv与lnp的peg化脂质化学缀合或共价连接以形成peg化脂质缀合物。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，与scfv化学缀合或共价连接的peg化脂质为dspe-peg。在一些实施方案中，与scfv化学缀合或共价连接的peg化脂质为dspe-peg2000。在一些实施方案中，与scfv化学缀合或共价连接的peg化脂质为dspe-peg5000。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质以约30％至约80％的摩尔百分比存在。在一些实施方案中，甾醇以约20％至约50％的摩尔百分比存在。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，非阳离子脂质以约2％至约20％的摩尔百分比存在。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，该至少一种peg化脂质以约2.1％至约10％的摩尔百分比存在。

68、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，scfv以约0.02μg/μgtna至约0.1μg/μg tna的总量存在。

69、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，药物组合物还包含地塞米松棕榈酸酯。

70、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，lnp的总脂质与tna的比率为约10:1至约40:1。

71、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，

72、lnp具有在约40nm至约120nm范围内的直径。

73、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，纳米颗粒具有小于约100nm的直径。

74、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，

75、纳米颗粒具有约60nm至约80nm的直径。

76、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，cedna包含表达盒，并且其中表达盒包含启动子序列和转基因。在一些实施方案中，表达盒包含多聚腺苷酸化序列。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，cedna包含至少一个反向末端重复序列(itr)，其侧接表达盒的5'或3'端。在一些实施方案中，表达盒侧接有两个itr，其中该两个itr包括一个5'itr和一个3'itr。在一些实施方案中，表达盒在3'端处连接到itr(3'itr)。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，表达盒在5'端处连接到itr(5’itr)。

77、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，该至少一个itr为源自aav血清型的itr、源自鹅病毒的itr的itr、源自b19病毒itr的itr、或来自细小病毒的野生型itr。在一些实施方案中，所述aav血清型选自由以下组成的组：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12。

78、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，5'itr和3'itr中的至少一者为野生型aav itr。

79、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，5'itr和3'itr中的至少一者为经修饰或突变的itr。

80、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，5'itr和3'itr为对称的。

81、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，5'itr和3'itr为不对称的。

82、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，cedna还包含5'itr与表达盒之间的间隔序列。

83、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，cedna还包含3'itr与表达盒之间的间隔序列。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，间隔序列的长度为至少5个碱基对长。

84、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，cedna具有切口或间隙。

85、在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，cedna为celid、基于dna的小环、midge、迷你串dna、在表达盒的5'端和3'端包含两个itr发夹结构的哑铃形线性双链体末端封闭的dna、或doggybonetmdna。

86、在一些方面，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文的任一方面和实施方案的药物组合物。在一些实施方案中，受试者为人。。

87、在一些方面，本公开提供了一种将治疗性核酸(tna)递送到受试者的肿瘤或增加tna的浓度的方法，其包括向受试者施用有效量的本文的任一方面和实施方案的药物组合物。

88、在一些方面，本公开提供了一种将治疗性核酸(tna)递送到受试者的肝脏或增加tna的浓度的方法，其包括向受试者施用有效量的本文的任一方面和实施方案的药物组合物。

89、根据一些实施方案，lnp被内化到细胞中。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，lnp包含阳离子脂质、甾醇或其衍生物、非阳离子脂质或peg化脂质。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，tna被包封在lnp中。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，tna选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、反义寡核苷酸(aso)、核酶、末端封闭的(cedna)、迷你串、doggybonetm、末端经前端粒封闭的dna或哑铃线性dna、切丁酶-底物dsrna、小发夹rna(shrna)、非对称干扰rna(airna)、微rna(mirna)、mrna、trna、rrna、dna病毒载体、病毒rna载体、非病毒载体以及它们的任何组合。根据一些实施方案，该tna为cedna。根据一些实施方案，该cedna为线性双链体dna。根据一些实施方案，该tna为mrna。根据一些实施方案，该tna为sirna。根据一些实施方案，该tna为质粒。

90、根据一些实施方案，lnp包含peg化脂质，其中peg化脂质与编码scfv(scfv多肽)的氨基酸序列连接。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，将药物组合物施用于受试者。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，受试者为需要用包封有tna的lnp治疗的人类患者。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，通过lnp中的scfv与抗原靶标的结合，组合物靶向表达靶抗原的细胞或组织。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，组合物靶向肿瘤细胞。根据一些实施方案，肿瘤为实体肿瘤。根据一些实施方案，肿瘤为血液学肿瘤。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，组合物靶向肝脏细胞。

91、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质由式(i)表示：

92、

93、或其药学上可接受的盐，其中：

94、r1和r1'各自独立地为任选取代的直链或支链c1-3亚烷基；

95、r2和r2'各自独立地为任选取代的直链或支链c1-6亚烷基；

96、r3和r3'各自独立地为任选取代的直链或支链c1-6烷基；

97、或者另选地，当r2是任选取代的支链c1-6亚烷基时，r2和r3与它们的居间n原子一起形成4元至8元杂环基；

98、或者另选地，当r2'是任选取代的支链c1-6亚烷基时，r2'和r3'与它们的居间n原子一起形成4元至8元杂环基；

99、r4和r4’各自独立地为-cra、-c(ra)2cra或-[c(ra)2]2cra；

100、ra每次出现时独立地为h或c1-3烷基；

101、或者另选地，当r4为-c(ra)2cra或-[c(ra)2]2cra并且当ra为c1-3烷基时，r3和r4与它们的居间n原子形成4元至8元杂环基；

102、或者另选地，当r4'为-c(ra)2cra或-[c(ra)2]2cra并且当ra为c1-3烷基时，r3'和r4'与它们的居间n原子一起形成4元至8元杂环基；

103、r5和r5'各自独立地为氢、c1-20亚烷基或c2-20亚烯基；

104、r6和r6'每次出现时独立地为c1-20亚烷基、c3-20亚环烷基或c2-20亚烯基；并且

105、m和n各自独立地为选自1、2、3、4和5的整数。

106、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质由式(ii)表示:

107、

108、或其药学上可接受的盐，其中：

109、a为1至20范围内的整数；

110、b为2至10范围内的整数；

111、r1不存在或选自(c2-c20)烯基、-c(o)o(c2-c20)烷基和被(c2-c20)烷基取代的环丙基；并且

112、r2为(c2-c20)烷基。

113、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，脂质由式(v)表示：

114、

115、或其药学上可接受的盐，其中：

116、r1和r1'各自独立地为任选地被一个或多个选自ra的基团取代的(c1-c6)亚烷基；

117、r2和r2'各自独立地为(c1-c2)亚烷基；

118、r3和r3’各自独立地为任选地被一个或多个选自rb的基团取代的(c1-c6)烷基；

119、或者另选地，r2和r3和/或r2'和r3'与它们的居间n原子一起形成4元至7元杂环基；

120、r4和r4'各自为被-c(o)o-中断的(c2-c6)亚烷基；

121、r5和r5'各自独立地为(c2-c30)烷基或(c2-c30)烯基，它们各自任选地被-c(o)o-或(c3-c6)环烷基中断；并且

122、ra和rb各自为卤素或氰基。

123、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质由式(xv)表示：

124、

125、或其药学上可接受的盐，其中：

126、r'不存在，为氢或c1-c6烷基；前提条件是当r'为氢或c1-c6烷基时，r'、r1和r2所附接到的氮原子均被质子化；

127、r1和r2各自独立地为氢、c1-c6烷基或c2-c6烯基；

128、r3为c1-c12亚烷基或c2-c12亚烯基；

129、r4为c1-c16非支链烷基、c2-c16非支链烯基，或其中：

130、r4a和r4b各自独立地为c1-c16非支链烷基或c2-c16非支链烯基；

131、r5不存在，为c1-c8亚烷基或c2-c8亚烯基；

132、r6a和r6b各自独立地为c7-c16烷基或c7-c16烯基；前提条件是r6a和r6b组合中的碳原子总数大于15；

133、x1和x2各自独立地为-oc(＝o)-、-sc(＝o)-、-oc(＝s)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)s-、-s-s-、-c(ra)＝n-、-n＝c(ra)-、-c(ra)＝no-、-o-n＝c(ra)-、-c(＝o)nra-、-nrac(＝o)-、-nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)o-、-osi(ra)2o-、-c(＝o)(cra2)c(＝o)o-或oc(＝o)(cra2)c(＝o)-；其中：

134、ra每次出现时独立地为氢或c1-6烷基；并且

135、n是选自1、2、3、4、5和6的整数。

136、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质由式(xx)表示：

137、

138、或其药学上可接受的盐，其中：

139、r'不存在，为氢或c1-c3烷基；前提条件是当r'为氢或c1-c3烷基时，r'、r1和r2所附接到的氮原子均被质子化；

140、r1和r2各自独立地为氢或c1-c3烷基；

141、r3为c3-c10亚烷基或c3-c10亚烯基；

142、r4为c1-c16非支链烷基、c2-c16非支链烯基，或其中：

143、r4a和r4b各自独立地为c1-c16非支链烷基或c2-c16非支链烯基；

144、r5不存在，为c1-c6亚烷基或c2-c6亚烯基；

145、r6a和r6b各自独立地为c7-c14烷基或c7-c14烯基；

146、x为-oc(＝o)-、-sc(＝o)-、-oc(＝s)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)s-、-s-s-、-c(ra)＝n-、-n＝c(ra)-、-c(ra)＝no-、-o-n＝c(ra)-、-c(＝o)nra-、-nrac(＝o)-、-nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)o-、-osi(ra)2o-、-c(＝o)(cra2)c(＝o)o-或oc(＝o)(cra2)c(＝o)-；其中：

147、ra每次出现时独立地为氢或c1-6烷基；并且

148、n是选自1、2、3、4、5和6的整数。

149、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质选自表2、表5、表6、表7或表8中的任何脂质。

150、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质为具有以下结构的脂质：

151、

152、或其药学上可接受的盐。

153、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质为具有以下结构的mc3(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(dlin-mc3-dma或mc3)：

154、

155、或其药学上可接受的盐。

156、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，甾醇或其衍生物为胆固醇或β-谷甾醇。根据一些实施方案，非阳离子脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺(dspe)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰基磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(dope-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆酰基磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰基磷脂酰基-乙醇胺(dspe)、单甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-o-单甲基pe)、二甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-o-二甲基pe)、18-1-反式pe、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(sope)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、卵磷脂酰胆碱(epc)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)、鞘磷脂(sm)、二肉豆酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、二肉豆酰基磷脂酰甘油(dmpg)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(dspg)、二芥酰基磷脂酰胆碱(depc)、棕榈酰基油酰磷脂酰甘油(popg)、二反式油酰基磷脂酰乙醇胺(depe)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dlpe)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dphype)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(esm)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱以及它们的混合物。根据一些实施方案，非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二硬脂基酰磷脂酰胆碱(dspc)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)。根据一些实施方案，peg化脂质选自由以下组成的组：peg-二月桂基氧基丙基；peg-二肉豆蔻基氧基丙基；peg-二棕榈基氧基丙基、peg-二硬脂基氧基丙基；l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(dmg-peg)；peg-二月桂基甘油；peg-二棕榈酰甘油；peg-二硬脂酰甘油；peg-二月桂酰糖酰胺；peg-二肉豆蔻酰糖酰胺；peg-二棕榈酰糖酰胺；peg-二硬脂酰糖酰胺；(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧辛酰基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)(peg-胆固醇)；3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚(peg-dmb)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n[甲氧基(聚乙二醇)(dspe-peg)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-聚(乙二醇)-羟基(dspe-peg-oh)。根据一些实施方案，peg化脂质为dmg-peg、dspe-peg、dspe-peg-oh或它们的组合。根据一些实施方案，该至少一种peg化脂质为dmg-peg2000、dspe-peg2000、dspe-peg2000-oh或它们的组合。

157、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，scfv与lnp的peg化脂质化学缀合或共价连接以形成peg化脂质缀合物。根据一些实施方案，与scfv化学缀合或共价连接的peg化脂质为dspe-peg。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，scfv通过不可切割的接头与lnp共价连接。根据一些实施方案，不可切割的接头是含马来酰亚胺的接头。

158、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，scfv通过可切割的接头与lnp共价连接。

159、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，scfv通过含有吡啶基二硫化物(pds)的接头与lnp共价连接。

160、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质以约30％至约80％的摩尔百分比存在。根据一些实施方案，甾醇以约20％至约50％的摩尔百分比存在。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，非阳离子脂质以约2％至约20％的摩尔百分比存在。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，该至少一种peg化脂质以约2.1％至约10％的摩尔百分比存在。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，scfv多肽以约0.02μg/μg tna至约0.1μg/μg tna的总量存在。

161、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，药物组合物还包括地塞米松棕榈酸酯。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，lnp的总脂质与tna的比率为约10:1至约40:1。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，lnp具有在约40nm至约120nm范围内的直径。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，纳米颗粒具有小于约100nm的直径。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，纳米颗粒具有约60nm至约80nm的直径。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，cedna包含表达盒，并且其中表达盒包含启动子序列和转基因。根据一些实施方案，表达盒包含多聚腺苷酸化序列。

162、根据上述方面和实施方案的一些实施方案，cedna包含至少一个反向末端重复序列(itr)，其侧接所述表达盒的5'或3'端。根据一些实施方案，表达盒侧接两个itr，其中两个itr包括一个5'itr和一个3'itr。根据一些实施方案，表达盒在3'端处连接到itr(3'itr)。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，表达盒在5'端处连接到itr(5'itr)。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，该至少一个itr为源自aav血清型的itr、源自鹅病毒的itr的itr、源自b19病毒itr的itr、来自细小病毒的野生型itr。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，aav血清型选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，5'itr和3'itr中的至少一者为野生型aav itr。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，5'itr和3'itr中的至少一者为经修饰或突变的itr。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，5'itr和3'itr为对称的。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，5'itr和3'itr为不对称的。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，cedna还包含在5'itr与表达盒之间的间隔序列。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，cedna还包含3'itr与表达盒之间的间隔序列。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，间隔序列的长度为至少5个碱基对长。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，cedna具有切口或间隙。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，cedna为celid、基于dna的小环、midge、迷你串dna、在表达盒的5'端和3'端包含两个itr发夹结构的哑铃形线性双链体末端封闭的dna、或doggybonetmdna。

163、根据另一个方面，本公开的特征在于治疗例如的方法。

164、根据另一个方面，本公开提供了一种将治疗性核酸(tna)递送到受试者的肿瘤或增加tna的浓度的方法，其包括向受试者施用有效量的本文的任一方面和实施方案的药物组合物。