嗜水气单胞菌突变株及其制备方法和应用与流程

本发明涉及微生物，特别涉及一种嗜水气单胞菌突变株及其制备方法和应用。

背景技术：

1、嗜水气单胞菌属于气单胞菌科、气单胞菌属，是一种革兰氏阴性短杆菌，有运动力。在水生环境中广泛存在，是一种革兰氏阴性菌，菌体呈直杆状有鞭毛，能够活动，无芽孢，无荚膜，兼性厌氧。该菌适应能力强，温度耐受范围广，从4℃-40℃都能够存活，并且其ph耐受性也很强，在自然界中分布广泛。

2、越来越多的证据表明，嗜水气单胞菌可引起软体动物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类等多种动物的全身性败血症或局部感染，常致动物大量死亡。20世纪80年代末在中国、菲律宾、泰国、印度等传统池塘养殖大国的鱼类爆发性疾病中，该菌被认为是重要的病原。人类因嗜水气单胞菌感染所致急性胃肠炎、食物中毒、败血症及伤口感染亦时有报道。鱼类感染嗜水气单胞菌后，感染可导致鲤鱼出血病、黄颡鱼腹水病和鳖白点病等，会暴发细菌性疾病，造成巨大的经济损失，阻碍了水产养殖业的可持续发展。嗜水气单胞菌还可以感染人，可导致人体皮肤感染、肠道炎症甚至败血症等疾病。嗜水气单胞菌不仅给养殖业带来巨大的经济损失，也严重影响到环境安全和人类健康，制约公共卫生发展。

3、嗜水气单胞菌通常情况下不致病，但是当水生环境恶劣、气温骤然改变或当水生动物的免疫力下降被其他病原菌侵袭时，可以与其他病原菌协同发病，致病菌通过毒力因子发挥致病作用，已研究的毒力因子如胞外蛋白酶、细胞外毒物（如溶血素、肠毒素）、细胞粘附因子（如菌毛和表面上蛋白质 s层）以及分泌系统等。

4、嗜水气单胞菌的结构对其侵染能力有很大的影响。有研究指出，病菌的鞭毛和菌毛均会影响细菌的致病性，细菌通过鞭毛运动，从而增强细菌对宿主的黏附作用。现有技术中对通过改变嗜水气单胞菌的结构进而改变其细菌侵染能力的未有研究。

5、因此，现有技术需要进行改进。

技术实现思路

1、现有技术中对通过改变嗜水气单胞菌的结构进而改变其细菌侵染能力的未有研究，因此，本发明提供了一种嗜水气单胞菌突变株及其制备方法和应用。

2、第一方面，本发明提供了一种嗜水气单胞菌突变株，其特征在于，所述嗜水气单胞菌突变株为 flpl基因缺失的且能稳定遗传的嗜水气单胞菌 flpl突变菌，所述嗜水气单胞菌突变株的保藏编号为cctcc m 2024135。

3、第二方面，本发明提供了一种嗜水气单胞菌突变株的制备方法，其包括以下具体步骤：

4、s1、提取嗜水气单胞菌全基因组；

5、s2、构建 flpl基因敲除所使用的引物；

6、s3、以所提取的嗜水气单胞菌全基因组为模板，使用引物进行目的基因上下游同源臂扩增和重叠延伸，得到 flpl基因缺失片段；

7、s4、通过自杀质粒pre112对嗜水气单胞菌的 flpl基因进行框内缺失突变，得到重组质粒pre112-δ flpl；

8、s5、将重组质粒转入wm3064感受态细胞，通过接合转移构建同源重组突变株，得到所述嗜水气单胞菌突变株。

9、在一种实现方式中，在s2中，所述引物包括 flpl-a、 flpl-b、 flpl-c、 flpl-d、 flpl-f、 flpl-r、pre112-f和pre112-r。

10、在一种实现方式中，在s3中，具体包括：

11、s31、以所提取的嗜水气单胞菌全基因组为模板，使用 flpl-a (xbai)/ flpl-b和 flpl-c/ flpl-d(saci)两对引物分别扩增 flpl的上下游同源臂，进行pcr反应；

12、s32、使用dna回收试剂盒分别纯化回收上下游同源臂，并调节至相同浓度，以此为模板，使用 flpl-a (xbai)/ flpl-d(saci)为引物，进行overlap pcr反应；

13、s33、对目的条带进行切胶回收，获得纯化的上下游同源臂融合片段，即 flpl基因缺失片段。

14、在一种实现方式中，在s4中，具体包括：

15、s41、用限制性内切酶xbai和saci对s3得到的 flpl基因缺失片段和自杀质粒pre112进行双酶切；

16、s42、使用t4连接酶连接纯化的 flpl基因缺失片段和pre112酶切产物，得到重组质粒pre112-δ flpl。

17、在一种实现方式中，在s5中，具体包括：

18、s51、制备接合转移专用菌株wm3064的感受态细胞；

19、s52、将重组质粒pre112-δ flpl转入wm3064感受态细胞获得wm3064-δ flpl；

20、s53、以pre112-f/pre112-r为引物对转化后平板上生长的wm3064做菌落pcr，进行同源重组；

21、s54、通过 flpl-a (xbai)/ flpl-d(saci) 引物扩增得到条带大小为974 bp的单条带的 flpl基因缺失片段长度。

22、第三方面，本发明所述嗜水气单胞菌突变株在制备水产动物的败血症或局部感染疫苗中的应用。

23、在一种实现方式中，所述嗜水气单胞菌突变株用于制备嗜水气单胞菌的弱毒活疫苗。

24、有益效果：本发明通过分子克隆技术、overlap pcr技术和同源重组技术，利用自杀载体对嗜水气单胞菌的 flpl基因进行框内缺失突变，获得 flpl基因缺失的且能稳定遗传的嗜水气单胞菌 flpl突变菌，能够稳定 flpl基因缺失的制备嗜水气单胞菌突变株；提供的嗜水气单胞菌突变株可以降低嗜水气单胞菌的毒力，能够为制备嗜水气单胞菌的弱病毒活疫苗提供必要材料，预防水产养殖中的嗜水气单胞菌感染，具有重要的临床价值。