一种基因编辑的CD8+T细胞及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种基因编辑的cd8+t细胞及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

背景技术：

1、cd8+t细胞又称细胞毒t淋巴细胞(cytotoxic t lymphocytes，ctl)，是适应性免疫系统(adaptive immune system)构建抗原特异性免疫保护机制的一条重要防线。cd8+t细胞在抗肿瘤免疫中承担着重要角色，其功能也预示着预后状态。免疫检查点阻断和过继性t细胞治疗的临床成功证明了cd8+t细胞介导抗肿瘤反应的潜力。然而，大多数癌症患者无法对免疫治疗产生长期反应，且肿瘤细胞对t细胞的长期不间断刺激极易引发t细胞的耗竭，导致其杀伤功能减弱并有可能促进肿瘤的发展及转移，严重影响预后。

2、因此需要提高cd8+t细胞的性能，以获得高杀伤力、抗耗竭的cd8+t细胞来提高t细胞治疗肿瘤的效果。

技术实现思路

1、为了克服肿瘤微环境中cd8+t细胞的耗竭问题，本发明提供了一种基因编辑的cd8+t细胞，其具有高杀伤力、抗耗竭的性能，可以“大量”、“高效”用于输入肿瘤患者体内用于肿瘤治疗。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面是提供一种基因编辑的cd8+t细胞，该cd8+t细胞的kdm6a基因通过基因编辑技术被敲除或敲低。

4、进一步地，上述基因编辑技术为同源重组技术、基于锌指核酸酶的基因编辑技术、talen基因编辑技术、crispr/cas基因编辑技术或rna干扰技术。

5、本发明的第二方面是提供上述cd8+t细胞的制备方法，包括如下步骤：

6、步骤一，提取及培养人外周血单个核细胞；

7、步骤二，提纯cd8+t细胞；

8、步骤三，采用rna干扰技术或crisper/cas 9基因敲除技术，敲除或敲低cd8+t细胞中的kdm6a基因。

9、进一步地，培养人外周血单个核细胞所采用的培养基为aim-v培养基，其中添加有abs和重组人il2蛋白；abs的浓度优选为2％，重组人il2蛋白的浓度优选为300u/ml。

10、进一步地，上述crisper/cas 9基因敲除技术采用的sgrna的靶基因序列为seq idno.1，rna干扰技术采用的shrna的靶基因序列选自seq id no.2～3中的一条或多条。

11、进一步地，上述crisper/cas 9基因敲除技术采用的grna的序列为seq id no.4。

12、本发明的第三方面是提供上述cd8+t细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。

13、进一步地，上述肿瘤选自人肝细胞癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌中的一种或多种。

14、本发明的第四方面是提供一种car-t细胞，其是通过在上述cd8+t细胞上表达肿瘤嵌合抗原受体获得。

15、本发明的第五方面是提供一种抗肿瘤的生物制剂，其包括上述cd8+t细胞或car-t细胞。

16、进一步地，上述肿瘤选自人肝细胞癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌中的一种或多种。

17、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

18、本发明实验结果表明，敲低或者敲除cd8+t细胞中的kdm6a基因可以产生更多记忆表型cd8+t细胞，在肿瘤微环境中也可降低cd8+t细胞的耗竭，从而提高对肿瘤细胞的强大杀伤力。crispr技术敲除kdm6a基因获得的cd8+t细胞可以用于在体外共培养后输入肿瘤患者体内进行细胞治疗；也可以直接将此种cd8+t细胞用于制备抗肿瘤药物，输入肿瘤患者体内后激活患者体内的免疫细胞进行细胞治疗，具有良好的临床应用前景。

技术特征：

1.一种基因编辑的cd8+t细胞，其特征在于，所述cd8+t细胞的kdm6a基因通过基因编辑技术被敲除或敲低。

2.根据权利要求1所述的cd8+t细胞，其特征在于，所述基因编辑技术为同源重组技术、基于锌指核酸酶的基因编辑技术、talen基因编辑技术、crispr/cas基因编辑技术或rna干扰技术。

3.如权利要求1或2所述的cd8+t细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述crisper/cas 9基因敲除技术采用的sgrna的靶基因序列为seq id no.1，rna干扰技术采用的shrna的靶基因序列选自seqid no2～3中的一条或多条。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述crisper/cas 9基因敲除技术采用的grna的序列为seq id no.4。

6.如权利要求1或2所述的cd8+t细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自人肝细胞癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌中的一种或多种。

8.一种car-t细胞，其特征在于，通过在如权利要求1或2所述cd8+t细胞上表达肿瘤嵌合抗原受体获得。

9.一种抗肿瘤的生物制剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的cd8+t细胞或如权利要求8所述的car-t细胞。

10.根据权利要求9所述的生物制剂，其特征在于，所述肿瘤选自人肝细胞癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌中的一种或多种。

技术总结本发明提供了一种基因编辑的CD8<supgt;+</supgt;T细胞及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。该CD8<supgt;+</supgt;T细胞的KDM6A基因通过基因编辑技术被敲除或敲低。本发明实验结果表明，敲低或者敲除CD8<supgt;+</supgt;T细胞中的KDM6A基因可以产生更多记忆表型CD8<supgt;+</supgt;T细胞，在肿瘤微环境中也可降低CD8<supgt;+</supgt;T细胞的耗竭，从而提高对肿瘤细胞的强大杀伤力。CRISPR技术敲除KDM6A基因获得的CD8<supgt;+</supgt;T细胞可以用于在体外共培养后输入肿瘤患者体内进行细胞治疗；也可以直接将此种CD8<supgt;+</supgt;T细胞用于制备抗肿瘤药物，输入肿瘤患者体内后激活患者体内的免疫细胞进行细胞治疗，具有良好的临床应用前景。技术研发人员：刘艳丰,高维强,李松玲受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属仁济医院技术研发日：技术公布日：2024/6/18