一种非人灵长类动物孤独症模型的构建方法

本发明属于生物，尤其涉及一种非人灵长类动物孤独症模型的构建方法。

背景技术：

1、孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，asd)是一类高度遗传的神经发育障碍性疾病，患者通常表现为在社会性和交流能力、语言能力存在问题以及仪式化的刻板行为。近年来，孤独症谱系障碍的患病率逐年上升，给患者及家庭社会造成了巨大负担。然而，由于孤独症的发病原因复杂、致病机制不清，目前仍无有效治疗方法。

2、目前，人类asd患者的研究主要是较低的时空分辨率非侵入性研究，难以深入揭示致病机制，因此孤独症动物模型的构建尤为重要。啮齿类动物被广泛地应用在孤独症的造模研究中，但由于其与人类亲缘关系较远，大脑的体积和复杂程度是无法和人类进行比拟的，能否准确模拟孤独症这类复杂的精神疾病存疑。而非人灵长类动物与人类具有很高的基因同源性，大脑结构和功能与人类较为相似，在社会属性上也具有相似性，是社交功能障碍疾病的良好动物模型。以非人灵长类为实验对象的asd研究也获得了一些进展，例如mecp2基因过表达的猕猴和shank3基因突变的猕猴均表现出重复刻板行为、社交行为障碍等类孤独症症状。然而，猕猴为单胎子代繁育，其培育周期较长，所以，非人灵长类动物构建孤独症模型仍存在实验周期长，实验对象无法形成族谱系等方面的缺陷，有待解决。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出了一种非人灵长类动物孤独症模型的构建方法，通过7t磁共振扫描成像技术(mri)对狨猴脑前额叶区精准定位注射aav-sacas9-mecp2敲除病毒，建立狨猴孤独症模型。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种非人灵长类动物孤独症模型的构建方法，包括以下步骤：

3、(1)定位非人灵长类动物的脑前额叶区；(2)向步骤(1)所述脑前额叶区注射aav-sacas9-mecp2敲除病毒液；(3)注射所述aav-sacas9-mecp2敲除病毒液8周后，对所述非人灵长类动物进行行为学测试。

4、优选的，所述非人灵长类动物为狨猴。

5、优选的，步骤(1)中所述定位采用7t磁共振扫描成像技术。

6、优选的，步骤(2)中所述注射的深度为1.5～3.5mm，所述注射的速度为150nl/min，所述注射的注射点有6个。

7、优选的，步骤(2)中所述aav-sacas9-mecp2敲除病毒液包括aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-a病毒液、aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-b病毒液和aav9-hsyn-gfp病毒液；所述aav-sacas9-mecp2敲除病毒液在每个注射点的注射量为3μl。

8、进一步优选的，所述aav-sacas9-mecp2敲除病毒液中aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-a病毒液、aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-b病毒液和aav9-hsyn-gfp病毒液的体积比为4:4:2；所述aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-a病毒液的滴度为1.12×1013vg/ml；所述aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-b病毒液的滴度为1.64×1013vg/ml；所述aav9-hsyn-gfp病毒液的滴度为2.18×1013vg/ml。

9、优选的，步骤(3)中所述行为学测试为单独情景社交和互动叫声社交测试，所述非人灵长类动物孤独症模型与野生非人灵长类动物相比，表现出单独情景社交的叫声数量和互动叫声社交的叫声数量显著下降。

10、本发明还提供了上述构建方法制备的非人灵长类动物孤独症模型。

11、本发明还提供了上述非人灵长类动物孤独症模型在研究广泛性发育障碍动物模型中的应用。

12、本发明还提供了一组特异靶向mecp2基因的sgrna，所述sgrna序列为seq id no.1和/或seq id no.2；

13、所述seq id no.1核苷酸序列为：accaccaccaucaccaccacu；

14、所述seq id no.2核苷酸序列为：ccuggggcucaggggggcugg。

15、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

16、本发明采用狨猴构建非人灵长类动物孤独症模型，利用狨猴培育周期短且狨猴具有繁殖双胞胎和三胞胎的优势，实现了对具有相同遗传条件的实验对象进行调控后，直接比较的研究方式；其次，狨猴叫声种类丰富，利用狨猴可以灵活运用其不同种类的叫声，在家庭成员内部和同伴之间进行信息传递和社会交流的特点，一应一答的叫声交流行为类比人类的对话行为的特点，建立了可仅依据孤独症狨猴具有语言交流障碍这一明显特征，构建非人灵长类动物孤独症模型的方法，克服了现有技术中仍存在的非人灵长类动物孤独症模型构建的缺陷。

17、本发明所述的非人灵长类动物孤独症模型构建方法通过crispr-cas9基因编辑技术在脑前额叶区注射aav腺相关病毒，敲除甲基化cpg结合蛋白2(mecp2)基因。mecp2基因主要对哺乳动物的学习记忆能力有着重要的影响，mecp2基因点突变、重复或缺失突变可导致rett综合征和孤独症等发育性神经精神疾病。本发明以敲除mecp2基因来诱导狨猴产生孤独症谱系障碍核心症状—语言交流障碍，利用对狨猴进行叫声行为学测试，评价孤独症语言交流障碍。

18、本发明的构建方法在多个狨猴实验个体中均表现为一致且可重复的结果，本发明为研究动物广泛性发育障碍提供了新的模型动物选择思路，本发明建立的狨猴孤独症模型可作为研究孤独症发病机制和药物筛选的重要工具，对于加深对孤独症的理解以及治疗和干预提供新的途径有重要意义。

技术特征：

1.一种非人灵长类动物孤独症模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述非人灵长类动物为狨猴。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述定位采用7t磁共振扫描成像技术。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述注射的深度为1.5～3.5mm，所述注射的速度为150nl/min，所述注射的注射点有6个。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述aav-sacas9-mecp2敲除病毒液包括aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-a病毒液、aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-b病毒液和aav9-hsyn-gfp病毒液；所述aav-sacas9-mecp2敲除病毒液在每个注射点的注射量为3μl。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述aav-sacas9-mecp2敲除病毒液中aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-a病毒液、aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-b病毒液和aav9-hsyn-gfp病毒液的体积比为4:4:2；所述aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-a病毒液的滴度为1.12×1013vg/ml；所述aav9-hsyn-sacas9-u6-sgmecp2-b病毒液的滴度为1.64×1013vg/ml；所述aav9-hsyn-gfp病毒液的滴度为2.18×1013vg/ml。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述行为学测试为单独情景社交和互动叫声社交测试，所述非人灵长类动物孤独症模型与野生非人灵长类动物相比，表现出单独情景社交的叫声数量和互动叫声社交的叫声数量显著下降。

8.如权利要求1～7任一项所述的构建方法制备的非人灵长类动物孤独症模型。

9.如权利要求9所述的非人灵长类动物孤独症模型在研究广泛性发育障碍动物模型中的应用。

10.一组特异靶向mecp2基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna序列为seq id no.1和/或seq id no.2；

技术总结本发明公开了一种非人灵长类动物孤独症模型的构建方法，属于生物技术领域，本发明所述非人灵长类动物孤独症模型的构建方法，包括以下步骤：(1)定位非人灵长类动物的脑前额叶区；(2)向所述脑前额叶区注射AAV‑SaCas9‑MECP2敲除病毒液；(3)注射所述AAV‑SaCas9‑MECP2敲除病毒液8周后，对所述非人灵长类动物进行行为学测试。本发明通过CRISPR‑Cas9基因编辑技术在脑前额叶区注射AAV腺相关病毒，敲除甲基化CpG结合蛋白2基因，以敲除MECP2基因来诱导狨猴产生孤独症谱系障碍核心症状—语言交流障碍，利用对狨猴进行叫声行为学测试，评价孤独症语言交流障碍。技术研发人员：高利霞,李倩冰,李新建,王晓会,谢敏受保护的技术使用者：浙江大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18