一种结合普通油茶果实性状的高产分子标记及育种方法

本发明涉及基因育种，更具体的说是一种结合普通油茶果实性状的高产分子标记及育种方法。

背景技术：

1、油茶(camellia oleifera abel.)是我国特有的木本油料树种，也是我国南方重要的木本食用油料物种。油茶主要种植在南方亚热带地区，广泛分布于南方丘陵地区，栽培面积大，其中普通油茶栽种面积最大。当前，油茶林产量相对较低，这与迅猛生长的茶油市场需求间存巨大矛盾，成为油茶产业发展面临的最主要困境之一。因此，培育高产油茶新品种是油茶产业稳健发展的关键。

2、数量性状呈连续性变异，受微效多基因的控制，易受环境影响。传统育种技术主要是针对表型的选择，选择和鉴定的结果易受环境影响而产生偏差。产量属数量性状，为了提高选择的准确性，需要通过多年的种植和选择，木本植物，需要花费十几二十年的时间。随着分子标记技术的发展，分子标记辅助选择(mas)为数量性状的高效选择提供了有效手段。通过关联分析发掘出有显著表型效应的候选基因的有益等位基因后，设计等位基因特异的pcr引物，进行标记的开发，并在遗传基础广泛的种质资源中对其进行验证，以用于广泛遗传背景下的mas，从而提高选择效率。利用功能标记进行mas，一方面选择的就是基因本身可以保证选择的准确性和提高选择的效率，另一方面利用关联分析，可以针对特定的影响性状变异的功能域进行选择保证了选择的效果。

3、在遗传育种中，果实相关的表型评价工作需要杂种实生苗定植开花结果后开展，存在鉴定周期长、占用土地资源与人力成本高等问题，不能满足快速准确地根据育种目标进行选择的需求。分子标记辅助选择(marker-assisted selection，mas)技术是利用与目标基因紧密连锁的分子标记来筛选优势基因型，获得目标个体的新兴技术，可以提高选择的准确性，缩短育种年限，提高育种效率。issr(inter-simple sequence repeats)简单序列重复区间，是一种显性标记，其操作简单，引物设计简单，多态性好，重复性高，实验成本低，实验稳定性高，是一种很好的dna指纹标记。

4、但目前在油茶中，分子标记技术主要应用于油茶遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系分析和杂种鉴定等领域，已开发了一些与茶油品质相关的分子标记，但尚未开发与产量紧密连锁的分子标记，也未见已开发的分子标记在杂交育种中应用的研究报道。

5、因此，如何开发一种与普通油茶产量紧密连锁的分子标记及育种方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种结合普通油茶果实性状的高产分子标记及育种方法。开发出了issr815、issr835和issr858这3个与普通油茶杂交种子性状紧密连锁的高产分子标记，获得815-11、835-12、858-2和858-3这4个基因位点，结合f1代及回交子代果实的果高和种子鲜重这2个性状，在回交子代中筛选普通油茶高产植株，利用该技术选育高产优良家系和高产单株，选择效率为75％，选择正确率为100％，高产单株可培育成高产新品种，也可直接作为杂交和回交亲本，解决了现有油茶杂交育种周期长、稳定性差和效率低的问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种结合普通油茶果实性状的高产分子标记，包括紧密连锁分子标记issr815、issr835和/或issr858；所述分子标记issr815包括815-11基因位点；所述分子标记issr835包括835-12基因位点；所述分子标记包括858-2和858-3两个基因位点；所述分子标记issr815扩增的引物序列为5'-ctctctctcctcctctg-3'，seq id no：1；所述分子标记issr835扩增的引物序列为5'-aga gag aga gag aga gyc-3'，seq id no：2；所述分子标记issr858扩增的引物序列为5'-tgt gtg tgt gtg tgt grt-3'，seq id no：3。

4、优选的，所述分子标记issr815的基因位点815-11与种仁干重存在极显著关联；所述分子标记issr835的基因位点835-12与种子鲜重以及单株产量存在极显著关联；所述分子标记issr858的基因位点858-2与果高存在极显著关联，基因位点858-3与种子鲜重存在极显著关联。

5、优选的，普通油茶单株产量与果高、种子鲜重呈极显著正相关。

6、优选的，所述基因位点835-12、858-2以及858-3为高产显性基因；所述基因位点815-11为高产隐形基因；所述基因位点835-12偏父性遗传，所述基因位点858-2和858-3偏母性遗传。

7、本发明的再一目的在于提供上述结合普通油茶果实性状的高产分子标记在普通油茶高产育种中的应用。

8、本发明的再一目的在于提供一种普通油茶高产育种的方法，包括如下步骤：

9、(1)亲本选取：选择10年以上盛产期单位冠幅面积产量大于1.2kg/m2的油茶树作为备选亲本，结合分子标记issr815、issr835和issr858辅助筛选亲本，选取显现835-12、858-2或858-3一种或多种基因位点的高产优株作亲本；

10、(2)亲本配置与杂交：选取步骤(1)中具有858-2和/或858-3基因位点的高产优株作为母本，具有835-12基因位点的高产优株作为父本，杂交，获得f1代；

11、(3)回交：选取f1代高产优株作为母本，选取步骤(2)具有835-12基因位点的父本作为回交父本进行回交，选取回交子代中高产优株作为轮回母本，与步骤(2)具有835-12基因位点的父本多次回交，得回交子代；

12、(4)回交子代高产优株的筛选：结合普通油茶回交子代的果实性状及基因型，在回交子代群体中，筛选杂交子代的高产优株，具体如下：

13、①结合表型筛选优良家系：在回交子代的果实群体中，筛选果高高于群体平均值，或种子鲜重高于群体平均值的家系，作为优良家系；

14、②结合表型在优良家系内筛选优良单株：以优良家系为基础，结合回交子代的果实性状，筛选出果高排名靠前且种子鲜重排名靠前的优良种子，培育成苗木；

15、③利用分子标记，在步骤②培育的苗木中利用分子标记issr815、issr835以及issr858选择显现815-11基因位点，并且至少显现835-12、858-2或858-3中一种的优良单株，即为普通油茶高产品种。

16、优选的，所述步骤(1)和(4)高产优株筛选过程中，当扩增出1600bp的单一条带时，代表检测植株具有815-11基因位点；当扩增出850bp单一条带时，代表检测植株具有835-12基因位点；当扩增出300bp单一条带时，代表检测植株具有858-2基因位点；当扩增出350bp单一条带时，代表检测植株具有858-3基因位点。

17、优选的，步骤(3)中总的回交次数≥2次。

18、优选的，步骤(3)中f1代高产优株的筛选过程同步骤(4)中回交子代高产优株的筛选过程。

19、本发明的再一目的在于提供一种结合普通油茶果实性状高产分子标记的扩增引物组，包括分子标记issr815、issr835和issr858的扩增引物，所述分子标记issr815扩增的引物序列如seq id no：1所示；所述分子标记issr835扩增的引物序列如seq id no：2所示；所述分子标记issr858扩增的引物序列如seq id no：3所示。

20、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

21、(1)本发明通过杂交群体构建，完成了普通油茶高产数量基因的累加及纯合，同时结合issr-pcr和普通油茶杂交果实性状，开发并筛选与普通油茶高产紧密连锁的分子标记issr815、issr835和issr858，获得815-11、835-12、858-2和858-3这4个基因位点，利用上述分子标记在自然群体中19个家系中选择普通油茶高产优良家系和植株，选择效率75％，正确率为100％，按照该方法获得普通油茶高产家系，产量高，平均单位冠幅面产量为2.86kg/m2，远远高于平均单位冠幅面产量1.2kg/m2的国家行业标准。

22、(2)本发明育种方法能获得性状稳定且产量高的优株后代供于品种试验，在每一个杂交世代，两年就可以成功获取高产优良品种，相比于现有技术需要十几二十年，极大缩短了育种周期，解决了现有油茶杂交育种周期长、稳定性差和效率低的问题。