一种短链脱氢酶及其在合成(R)-四氢噻吩-3-醇中的应用

本发明属于酶工程，具体涉及一种短链脱氢酶及其在合成(r)-四氢噻吩-3-醇中的应用。

背景技术：

1、手性醇是医药合成领域中重要的药物砌块，其合成方法受到了不同研究人员的广泛关注，包括强还原剂催化还原前手性酮，以及脂肪酶立体选择性的催化酯类化合物水解以获得单一构型的手性醇等。生物催化合成由于具有立体和区域选择性好、反应条件温和、操作简单、环境友好等优点，成为手性医药化学品绿色制造的重要途径，其中酮还原酶催化前手性酮不对称还原直接生成手性醇，在手性醇的合成路径中脱颖而出，其优异的立体选择性以及简单的工艺、高效的催化效率受到了研究人员的广泛关注。

2、硫培南是一种具有口服活性的肠胃外青霉烯类抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱活性。它可用于尿路感染和腹腔内感染的研究，它对铜绿假单胞菌和嗜黄单胞菌的嗜麦芽孢杆菌无效。(r)-四氢噻吩-3-醇作为合成硫培南的关键中间体，已经被各大公司广泛研究，例如wo2009/029554a2以及cn109796434所提及的使用生物法合成(r)-四氢噻吩-3-醇。在wo2009/029554a2中，在酮还原酶催化还原四氢噻吩-3-酮浓度为150g/l时，酶浓度为1.5g/l，反应24h后转化率达到99％。在cn109796434中，四氢噻吩-3-酮浓度达到了300g/l，酶浓度为200g/l，反应在20h后终止，转化率为99％。在wo2009/029554a2中底物浓度为150g/l，底物与催化剂的比例为100，而在cn109796434中，底物浓度为300g/l，底物与催化剂的比例为2。上述合成方法分别存在一些问题，如底物浓度较低(150g/l)、酶的催化效率较差(底物与催化剂的比例为2)以及酶稳定性不足(在cn109796434中酮还原酶在37℃下催化四氢噻吩-3-酮还原时最终产物转化率停留在了92％)等问题。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种短链脱氢酶及其在合成(r)-四氢噻吩-3-醇中的应用。本发明成功获得了一种短链脱氢酶属酮还原酶，其在催化四氢噻吩-3-酮还原时，底物浓度达到了300g/l，底物与催化剂的重量比为10：1，且酶的最适温度在50℃，在70℃下孵育1h活性仍保留初始活性的69％，表现出了高底物耐受、较高的催化效率以及优异的热稳定性。

2、本发明的第一个目的是提供一种短链脱氢酶，所述短链脱氢酶的氨基酸序列为序列表中seq id no.2；

3、作为优选，所述短链脱氢酶的核苷酸序列为序列表中seq id no.1。

4、本发明的第二个目的是提供包含上述核苷酸序列的表达载体或宿主细胞；

5、作为优选，所述表达载体为原核表达载体；

6、作为进一步优选，所述原核表达载体为pet-28a；

7、作为优选，所述宿主细胞为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。

8、本发明的第三个目的是提供上述的短链脱氢酶、表达载体或宿主细胞在合成(r)-四氢噻吩-3-醇中的应用。

9、本发明的第四个目的是提供上述的一种合成(r)-四氢噻吩-3-醇的方法，以四氢噻吩-3-酮为底物，以上述的短链脱氢酶为催化剂，以葡萄糖为辅助底物，以葡萄糖脱氢酶为辅酶，构建nadph循环再生体系，加入缓冲溶液，进行不对称还原制备(r)-四氢噻吩-3-醇。

10、上述制备完成后，使用高效气相色谱法或高效液相色谱法检测产率和ee值。

11、高效气相色谱的检测条件为：色谱柱cp-chirasil-dex cb cp7503或β-dex 120，160℃恒温检测。

12、高效液相色谱的检测条件为：chiralcel ad色谱柱，流动相为异丙醇/正己烷(v/v)＝2:98，流速2ml/min，检测波长为210nm。

13、作为优选，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列为序列表中seq id no.4；作为优选，所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列为序列表中seq id no.3。

14、作为优选，所述催化剂包括短链脱氢酶湿菌体、含短链脱氢酶的冻干大肠杆菌细胞、短链脱氢酶的粗酶液和冻干短链脱氢酶粉；优选所述催化剂为含短链脱氢酶的冻干大肠杆菌细胞；所述和/或

15、所述辅酶包括葡萄糖脱氢酶湿菌体、含葡萄糖脱氢酶的冻干大肠杆菌细胞、葡萄糖脱氢酶的粗酶液和冻干葡萄糖脱氢酶粉；优选所述辅酶为含葡萄糖脱氢酶的冻干大肠杆菌细胞。

16、上述短链脱氢酶湿菌体或葡萄糖脱氢酶湿菌体为：含有短链脱氢酶属酮还原酶基因或葡萄糖脱氢酶的重组工程菌。

17、上述短链脱氢酶的冻干大肠杆菌细胞或葡萄糖脱氢酶的冻干大肠杆菌细胞的制备方法为：将含有短链脱氢酶或葡萄糖脱氢酶的重组工程菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃过夜培养12-16h，优选16h。再以10％的接种量接种至含有3ltb培养基的5l发酵罐中，调节转速至500-600rpm，通气量为1-1.5(v/v)，温度为37℃进行扩大培养，待od600至1.6-2.0时，进行工程基因的诱导表达。优选地，扩大培养条件为调节转速至600rpm，通气量为1.5(v/v)，温度为37℃进行扩大培养，待od600至1.8时，进行工程基因的诱导表达。

18、诱导表达的发酵条件为，转速调节至500rpm，通气量为1(v/v)，温度为25℃，诱导剂iptg的终浓度为1mm，诱导表达12h；或采用溶氧控制发酵过程：待扩大时溶氧降至60％后，加入1mm的诱导剂iptg，并串联转速控制溶氧置于30％，温度为25℃。培养结束后，采用絮凝法收集细胞，具体方法为，向培养完成的培养基中加入海藻酸钠和壳聚糖溶液，收集含短链脱氢酶的冻干大肠杆菌细胞或含葡萄糖脱氢酶的冻干大肠杆菌细胞并洗涤，完成后置于-20℃冷冻过夜，之后置于冷冻干燥机中冷冻获得冻干大肠杆菌细胞。

19、上述短链脱氢酶的粗酶液或葡萄糖脱氢酶的粗酶液的制备方法为：将获得的短链脱氢酶或葡萄糖脱氢酶的湿菌体，用50mlph 7.5、50mm的磷酸盐缓冲溶液重悬，使用匀浆破碎仪破碎，破碎条件为3ml/s，压力范围为700-800mpa，破碎时间45-60s；优选地，破碎条件为3ml/s，压力为800mpa，破碎时间为60s。破碎完成后，将破碎液置于4℃，12000rpm，离心15min，收集上清液(即为粗酶液)。使用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，使用moleculardevices酶标仪进行酶活测定。

20、上述冻干短链脱氢酶粉或冻干葡萄糖脱氢酶粉的制备方法为：将上述收集得到的上清液置于冻干机托盘中-20℃冷冻至完全凝固，后取出放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h，收集托盘粉末即为冻干酶粉。

21、作为优选，所述底物的浓度为100-300g/l；优选所述底物的浓度为300g/l；和/或

22、所述催化剂的用量为10-30g/l，优选为30g/l；和/或

23、所述辅酶的用量为10-15g/l，优选为15g/l；和/或

24、所述葡萄糖的浓度为600-750g/l，优选为700g/l。

25、作为优选，所述底物与催化剂的重量比为10：1；和/或

26、制备时的反应温度为40-55℃，优选所述反应温度为45℃。

27、作为进一步优选，所述缓冲溶液为ph 6.0-7.5的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液，优选所述缓冲溶液为ph 6.5的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液；或

28、所述缓冲溶液为ph 6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；或

29、所述缓冲溶液为ph 7.5的tris-盐酸缓冲溶液。

30、本发明技术方案的有益效果如下：

31、(1)本发明的短链脱氢酶在催化底物四氢噻吩-3-酮时，可以耐受的底物浓度达300g/l。

32、(2)本发明的短链脱氢酶在70℃高温下孵育一小时后，仍能展现出69％的活性。相比于多数酮还原酶由于热不稳定而造成的成本问题，本发明的短链脱氢酶拥有着极其优异的热稳定性，有效解决了酮还原酶热稳定差的问题。

33、(3)本发明的短链脱氢酶可以用于制备(r)-四氢噻吩-3-醇，其中酶活0.8u/mg蛋白，其对目标底物四氢噻吩-3-酮的转化率高达99％以上，对产物(r)-四氢噻吩-3-醇的对映体选择性高达99％，在用于300g/l底物浓度的反应时，仍表现出较高的催化效率。

34、(4)本发明的短链脱氢酶的最适温度为50℃。

35、(5)在转化反应中，底物与催化剂的重量比达到了10:1。