一种无线微电极细胞贴片的批量制备方法及其在远程诱导干细胞神经分化中的应用

本发明涉及一种无线微电极细胞贴片的批量制备方法及其在远程诱导干细胞神经分化中的应用，属于生物医学领域。

背景技术：

1、创伤性脑损伤是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。脑损伤会严重影响神经系统，导致患者功能障碍，甚至威胁患者生命。脑损伤的自愈合能力非常差，这是由于体内神经元无法再生，脑损伤后的脑组织会形成空洞或者被胶质瘢痕替代。神经干细胞移植是一种治疗脑损伤的有效手段，在以往的研究中，已经证明在脑损伤的动物模型中植入神经干细胞可以改善脑组织的结构。但是由于干细胞分化效率低，速度慢，限制了神经干细胞在脑损伤治疗中的应用。

2、电刺激是治疗神经系统疾病的一种有效措施，可以激活细胞内信号通路，影响细胞迁移、增殖和分化。电刺激会改变细胞膜表面电荷分布，激活膜受体和离子通道，促进神经分化。但是，传统的电刺激设备需要通过导线将电信号输入和输出设备连接，容易导致感染，并且需要植入大量导电支架，操作复杂，成本高。如中国专利文献cn105087544a一种诱导骨髓间充质干细胞分化及增殖的方法及装置，采用对机体和细胞均无害的低频交流电，采用物理刺激的方法刺激干细胞，使其能够向神经方向分化；且此方法易操作，能随时给予电刺激，具有很高的可控性。

3、基于电磁感应现象，导体在磁场中运动产生感应电动势可以实现无线电刺激。然而，传统的导电材料由于其尺寸限制，即使使用无线电刺激，对每一个处于动态迁移状态的移植干细胞进行精确的电刺激仍然是一个巨大的挑战。

4、比如中国专利文献cn111944750a一种无线电刺激响应的三维环形细胞支架及其制备方法与应用。所述制备方法包括：采用化学气相沉积法在铜/镍模板上生长石墨烯，制得三维环形细胞支架；或者，将导电物质与纤维进行混纺处理形成导电纤维，之后采用模板法进行处理，制得三维环形细胞支架；或者，采用3d打印的方法将导电水凝胶和/或导电气凝胶进行打印，制得三维环形细胞支架，该三维环形细胞支架尺寸大，无法通过微注射植入体内，且无法随细胞流动迁移，因此无法实现对干细胞的精确电刺激。

5、如何设计一种无线电极使其贴在细胞膜上而不被细胞内吞，实现在细胞膜上长期锚定，在物理场驱动下产生电信号，实现对动态迁移干细胞的精准刺激，诱导干细胞的神经分化，是目前亟需解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种无线微电极细胞贴片的批量制备方法及其在远程诱导干细胞神经分化中的应用。

2、本发明是通过如下技术方案实现的：

3、无线微电极细胞贴片的批量制备方法，包括步骤如下：

4、1)将石墨芯作为工作电极，铂箔作为对电极，硫酸作为电解质，对石墨芯进行电化学剥离；

5、2)剥离完成后，进行抽滤，收集剥离的石墨烯，去离子水清洗；

6、3)清洗后的石墨烯重新分散在去离子水中，得石墨烯分散液，静置，取上清液；

7、4)上清液灭菌处理后加入层粘连蛋白溶液进行孵育，得到无线微电极细胞贴片。

8、根据本发明优选的，步骤1)中，石墨芯的型号为12b-16b。

9、根据本发明优选的，步骤1)中，硫酸的浓度为0.1-0.3m。

10、根据本发明优选的，步骤1)中，电化学剥离施加的电压为+10v。

11、根据本发明优选的，步骤1)中，电化学剥离时间为10-60min，过程中进行磁力搅拌。

12、根据本发明优选的，步骤2)中，抽滤收集石墨烯使用的滤膜孔径为0.22μm。

13、根据本发明优选的，步骤2)中，使用去离子水清洗3-5次。

14、根据本发明优选的，步骤3)中，石墨烯分散液中石墨烯的浓度为1-10mg/ml。

15、根据本发明优选的，步骤3)中，静置时间为24-48h。

16、根据本发明优选的，步骤3)中，灭菌处理为上清液进行高压处理。

17、根据本发明优选的，步骤3)中，层粘连蛋白溶液的浓度为0.5-5μg/ml。

18、根据本发明优选的，步骤3)中，孵育温度为37℃，孵育时间为1-8h。

19、本发明制得的无线微电极贴片尺寸在1-10μm，尺寸小，缺陷较少，具有良好的导电性，为具有微米级、各向异性的石墨烯纳米电贴片，可以避免被细胞内吞，并且可以高效、稳定、长期地结合在细胞膜表面，通过电化学法剥离石墨烯，通过电流驱使离子迁移到石墨层间隔中将石墨烯层剥离得到，方法极其简单，成本低，并且可以批量化生产。

20、一种无线微电极细胞贴片，采用上述方法制得。

21、上述无线微电极细胞贴片在制备治疗脑损伤贴片复合体中的应用。

22、一种治疗脑损伤修复的贴片复合体，包括无线微电极细胞贴片和干细胞。

23、根据本发明优选的，治疗脑损伤修复的贴片复合体的制备方法，步骤如下：

24、(1)将干细胞离心吹打后用神经分化培养基重新分散，得到干细胞悬液；

25、(2)向干细胞悬液中加入无线微电极细胞贴片分散液，得混合液，进行孵育；

26、(3)孵育后进行离心，去除上清液，得到治疗脑损伤修复的贴片复合体。

27、根据本发明优选的，步骤(1)中，神经分化培养基为含体积浓度2％ b27神经培养添加剂，体积浓度1％胎牛血清(fbs)，体积浓度1％ glutamax和体积浓度1％双抗的neurobasal培养基。

28、neurobasal培养基为现有技术。

29、根据本发明优选的，步骤(1)中，干细胞为神经干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或胚胎干细胞。

30、根据本发明优选的，步骤(1)中，干细胞悬液中干细胞的浓度为(0.5-10)×106个/ml。

31、根据本发明优选的，步骤(2)中，混合液中无线微电极细胞贴片的浓度为10-160μg/ml，干细胞的浓度为(0.5-10)×106个/ml。

32、根据本发明优选的，步骤(2)中，孵育环境为恒温振荡摇床，孵育温度为37℃，摇床振荡频率为50-200rpm，孵育时间为0.5-24h。

33、根据本发明优选的，步骤(3)中，离心的速度为600-900rpm，离心的时间为3-5min。

34、本发明制得的无线微电极贴片能高效结合在不同类型的干细胞上，并跟随动态迁移的干细胞移动，迁移至损伤区域后，进行旋转磁场刺激，实现神经分化；不影响干细胞的增殖分化，可以在细胞表面长期稳定锚定，对细胞实现长期精准电刺激。

35、上述治疗脑损伤修复的贴片复合体的应用，用于在磁场驱动下介导无线电刺激实现神经分化。

36、根据本发明优选的，治疗脑损伤修复的贴片复合体的应用，将治疗脑损伤修复的贴片复合体接种在细胞培养板中，体外培养，进行旋转磁场刺激，实现神经分化。

37、根据本发明优选的，接种的细胞悬液体积为0.5-2ml，包含的细胞个数为1-4×106个；

38、根据本发明优选的，体外培养为在37℃下含5％ co2的饱和湿度环境下体外培养5-10天。

39、根据本发明优选的，细胞培养板到磁铁的距离为0.5-1cm，旋转磁场刺激条件为：转速为100-1000rpm，磁场强度为50-100mt，每次刺激时间为10-30min，每天刺激1-3次。

40、本发明的技术特点及优点：

41、1、本发明通过电化学法剥离，通过电流驱使离子迁移到石墨层间隔中将石墨烯层剥离得到石墨烯片，然后与层粘连蛋白孵育，得到无线微电极细胞贴片。通过硫酸浓度和施加电压的控制以及静置，得到的无线微电极细胞贴片尺寸小，尺寸在1-10μm，缺陷较少，石墨烯结构完整，具有良好的导电性。微米级、各向异性的无线微电极细胞贴片，可以避免被细胞内吞，并且可以高效、稳定、长期地结合在细胞膜表面，方法极其简单，成本低，并且可以批量化生产，效率高。

42、2、本发明无线微电极细胞贴片可以长期稳定锚定在多种类型的干细胞膜表面，并跟随动态迁移的干细胞移动，如神经干细胞，骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞，胚胎干细胞等，适用范围广，不影响干细胞的增殖分化，对干细胞实现长期伴随式精准电刺激。

43、3、本发明的无线微电极细胞贴片可以基于电磁感应原理，在旋转磁场驱动下产生无线电刺激，通过调控磁场强度和频率，改变电信号的强度和频率，实现定时、定量对干细胞进行精确电刺激，避免有些细胞电刺激不到，可以明显促进神经分化，并促进神经发育成熟，为临床上脑损伤修复，改善脑损伤行为，促进损伤区域修复作了重要指导。