一种甲萘醌-7的发酵生产方法与流程

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用纳豆芽孢杆菌进行液体发酵生产甲萘醌-7的方法。

背景技术：

1、维生素k2(menaquinone，mk，vk2)是一类甲萘醌类化合物的统称，化学结构式为2-甲基-3-烯基-1,4-萘醌，根据c-3侧链上异戊二烯单元的个数，mk可分为14种，以mk-n表示(n＝1-14)，代表性的分子是mk-4(甲萘醌-4)和mk-7(甲萘醌-7)。已知甲萘醌-7是活性最强的维生素k2中的一种，其具备功能广泛、活性强大、半衰期长、安全等特点，主要对细胞的生长代谢及防止心脑血管和肾脏血管的钙化起着非常重要的作用。

2、维生素k2微生物发酵生产菌株主要包括革兰氏阳性菌中的纳豆芽孢杆菌(bacillus subtilis natto)和革兰氏阴性菌中的黄杆菌属(flavobacterium sp.)。其中纳豆芽孢杆菌主要产维生素k2，又因其菌体本身为益生菌，所产的维生素k2也具有较高的产量和较好的生物相容性，因此是发酵生产维生素k2的优良菌种。但现有技术中，纳豆芽孢杆菌生长旺盛，发酵代谢指标不稳定，过程控制难度大，容易形成大量芽孢或者代谢异常生成γ-聚谷氨酸，导致目标产物合成中止。同时过程中消耗大量的营养物质，改变了发酵液的流体性质，增加流体粘度，造成氧扩散效果差，使局部缺氧，搅拌动力能耗急剧增加，也会给后续提纯纯化工序造成技术上的困难。因此，研究发酵菌株特性及发酵行为对于提高发酵生产维生素k2的生产性能具有重要意义。

3、2016年，牟杰等以香菇菌渣复配蛋白胨为氮源(5％)、甘油为碳源(5％)，采用高转速(600r/min)、高溶氧量(do>20％)进行纳豆芽孢杆菌发酵时,vk2收率最高可达35.58mg/l(牟杰等.纳豆芽孢杆菌生产维生素k2的连续发酵工艺优化.《食品工业科技》.2016,第19期)。

4、2019年，汤贵祥等筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，使用优化后培养基(5％甘油、12％大豆蛋白胨、0.07％磷酸氢二钾、0.02％氯化钙、0.05％七水硫酸镁)进行发酵，vk2产量可达70mg/l以上(汤贵祥，《维生素k2高产菌株的筛选与发酵条件优化》.《食品工业科技》.2019，第24期)。

5、中国专利zl201910822357.0：一种维生素k2(mk-7型)的发酵方法，在使用纳豆芽孢杆菌进行发酵的过程中发酵培养基配方为葡萄糖6.0％，甘油3.0％，酵母粉1.2％，大豆蛋白胨1.2％，nacl 0.28％，kh2po4 0.05％，mgso4·7h2o 0.05％，溶剂为水，ph7.0-7.2。发酵过程中流加葡萄糖，补加磷酸、氨水，分阶段严格控制ph，通过调节转速、空气流量、罐压分阶段控制溶氧，发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7％左右，发酵单位可达80mg/l。

6、中国专利申请cn111549079 a：一种采用微生物发酵法制备维生素k2的方法，在纳豆枯草芽孢杆菌发酵过程中，分阶段将our、发酵液中orp及乳酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；在发酵培养5～20h后，往发酵液中加入辅料，所述辅料选自烟酰胺、维生素b12和甲硫氨酸中的至少一种，发酵产量可达139mg/l。

7、虽然众多研究开展了微生物发酵生产vk2的研究，但发酵技术仍不成熟。针对发酵过程中生物量低、生产速率低等问题，本发明对纳豆芽孢杆菌深层液体发酵生产甲萘醌-7的发酵条件进行优化，达到提高最终菌体生物量和目标产物产率的目的，以期实现甲萘醌-7的大规模工业化生产。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服采用现有的微生物发酵法制备甲萘醌-7存在发酵水平普遍偏低、所得发酵产物中甲萘醌-7含量较低的缺陷，提供一种能够有效提高发酵水平、所得发酵产物中甲萘醌-7含量较高的纳豆芽孢杆菌液体发酵工艺。

2、本发明发酵工艺利用本公司获得的mk-7高产纳豆芽孢杆菌(bacillus natto)(原始编号为hdcc00023，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21799，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。

3、本发明提供一种甲萘醌-7的液体发酵方法，在发酵过程中，阶段性补加甘油与莽草酸。

4、一种优选技术方案，分阶段补加的甘油与莽草酸体积比为3～1:1，更优选2:1。。

5、更优选技术方案，发酵进程中，发酵液甲萘醌-7效价高于100ug/ml至每天增量低于40ug/ml阶段，每天补加甘油与莽草酸，使补料在培养基中的体积含量为0.5～2％，优选1％。。

6、一种优选技术方案，在发酵过程中，分阶段控制发酵液ph值。

7、优选技术方案，在发酵过程中，通过补入naoh溶液，分阶段控制发酵液ph值。

8、更优选技术方案，补入naoh溶液将发酵液ph值分阶段控制在以下范围，发酵液od600趋于稳定前，ph值7.0～7.3；发酵液od600趋于稳定后，ph值7.3～7.6。

9、一种优选技术方案，在发酵过程中，分阶段控制发酵液碳源浓度。

10、优选技术方案，在发酵过程中，通过补入麦芽糊精溶液，控制发酵液残糖浓度≥2％。

11、一种优选技术方案，在发酵过程中，通过补入鱼蛋白胨溶液，控制发酵液溶氨在500～1500ppm之间。

12、一种优选技术方案，如前所述发酵方法为纳豆芽孢杆菌的发酵，纳豆芽孢杆菌优选hdcc00023。

13、本发明提供一种包含mk-7的发酵液，发酵液通过上述任一所述的发酵方法产生。

14、本发明提供一种制备mk-7的方法，通过得到前述所述的mk-7发酵液，随后进行纯化。

15、本发明提供一种制备包含mk-7的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料的方法，制备mk-7的方法如前所述的制备方法。

16、本发明提供了一种利用纳豆芽孢杆菌液体深层发酵生产甲萘醌-7的生产工艺，其优点主要体现在：(1)发酵所产甲萘醌-7效价可达到500mg/l以上，相对于现有技术有了大幅度提高；(2)该纳豆芽孢杆菌发酵工艺简单可控，有利于工业化扩大生产。

技术特征：

1.一种甲萘醌-7的液体发酵方法，其特征在于：在发酵过程中，阶段性补加甘油与莽草酸。

2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述甘油与莽草酸体积比为3～1:1，优选2:1。

3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：在发酵进程中，发酵液甲萘醌-7效价高于100ug/ml至每天增量低于40ug/ml阶段，每天补加甘油与莽草酸，使补料在培养基中的体积含量为0.5～2％，优选1％。

4.如权利要求1至3任一所述的发酵方法，其特征在于：在发酵过程中，分阶段控制发酵液ph值。

5.如权利要求4所述的发酵方法，其特征在于：在发酵过程中，通过补入碱性溶液分阶段控制发酵液ph值，碱性溶液优选naoh溶液。

6.如权利要求5所述的发酵方法，其特征在于：在发酵过程中，补入naoh溶液将发酵液ph值分阶段控制在以下范围，发酵液od600趋于稳定前，ph值7.0～7.3；发酵液od600趋于稳定后，ph值7.3～7.6。

7.如权利要求1至3任一所述的发酵方法，其特征在于：在发酵过程中，分阶段控制发酵液碳源浓度。

8.如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于：在发酵过程中，通过补入麦芽糊精溶液，控制发酵液残糖浓度≥2％。

9.如权利要求1至3任一所述的发酵方法，其特征在于：在发酵过程中，补入鱼蛋白胨溶液，控制发酵液溶氨在500～1500ppm之间。

10.如权利要求1至3任一所述的发酵方法，其特征在于：发酵培养基包含质量百分比的棉籽精粉2％、鱼蛋白胨2％、麦芽糊精6％、蔗糖4％、泡敌0.5％，ph7.6。

11.如权利要求10所述的发酵方法，其特征在于：所述发酵方法为纳豆芽孢杆菌的发酵。

12.如权利要求11所述的发酵方法，其特征在于：所述的纳豆芽孢杆菌为hdcc00023。

13.一种包含甲萘醌-7的发酵液，其特征在于：所述发酵液通过权利要求1至12任一项的发酵方法产生。

14.一种制备甲萘醌-7的方法，其特征在于：包括通过权利要求1至12任一项的发酵方法产生甲萘醌-7发酵液，随后进行纯化。

15.一种制备包含甲萘醌-7的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料的方法，其特征在于：制备甲萘醌-7的方法如权利要求14所述。

技术总结本发明公开了一种利用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)生产甲萘醌‑7的发酵工艺，属于微生物发酵领域。本发明在纳豆芽孢杆菌的发酵过程中利用优化培养基，同时采用分阶段补加甘油与草莽酸，分阶段控制发酵液pH值、残糖含量与溶氨量的工艺。该发酵生产方法甲萘醌‑7产量高，发酵工艺简单可控，有利于甲萘醌‑7的工业化扩大生产。技术研发人员：张正,陈辅辰,陈誉民,邹乐,叶世豪受保护的技术使用者：湖北美琪健康科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18