一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体

本发明涉及一种酰胺酶，尤其涉及一种副球菌paracoccus sp kdspl-02来源的酰胺酶及其突变体，属于生物化学与酶催化。

背景技术：

1、酰胺酶的来源十分广泛，在细菌、酵母和真菌中都有发现。以青霉素酰化酶为例，其能水解青霉素g生成苯乙酸和6-氨基青霉烷酸(6-apa)，其中6-apa是工业中生产β-内酰胺类抗生素的重要中间体，因此青霉素g酰化酶在工业生产中显得尤为重要。青霉素酰化酶属于酰胺酶家族中的一员，在n-末端位置具有丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸等的活性位点，在生物催化中起着转移酶的作用。在水溶液中该活性位点残基与酰基的疏水基团(例如苯基)特异性相互作用，导致形成酰基酶中间体。

2、在β-内酰胺类半合成抗生素的制备过程中，青霉素酰化酶(酰胺酶)扮演了重要的角色，其可水解青霉素g获得重要的中间体6-apa。而在有机溶剂中，其又能催化6-apa与d-苯基甘氨酸甲酯或对羟基-d-苯基甘氨酸甲酯发生反应，实现6-apa氨基上的酰化。

3、近年来，青霉素酰化酶在欧美的一些发达国家中需求量逐渐上升，我国在微生物产青霉素酰化酶方面的研究与开发取得了巨大的进展。本课题组前期筛选得到一株高效水解青霉素的菌株，即paracoccus sp.kdspl-02，提示在该菌中，具有高效水解青霉素的酶。到目前为止，源于副球菌的酰胺酶(青霉素酰化酶)和突变体及其相关催化应用尚无报道。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体，及其克隆表达制备及应用。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种副球菌来源的酰胺酶，所述酰胺酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，副球菌以保藏编号cgmcc no.12494保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。命名为paracoccus sp.kdspl-02。

3、一种副球菌来源的酰胺酶，命名为pa404w，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明通过定点突变，在野生型副球菌酰胺酶pa404w的基础上引入突变位点，将其274位苯丙氨酸(phe)突变为丙氨酸(ala)，突变体(pm-f274a)氨基酸序列如seq id no.2所示。同样利用定点突变，继续将突变体f274a的404位色氨酸(trp)突变为甘氨酸(gly)，形成双突变体，命名为pm-f274a/w404g。

5、本发明提供了包含所述基因的表达盒、重组载体和重组转化子。

6、所述重组载体的原始载体具体可以为pgex-6p-1，将其原始质粒中amp抗性基因盒置换为kan抗性基因盒。

7、所述重组转化子的宿主细胞为大肠杆菌，具体可以为大肠杆菌bl21(de3)或jm109。

8、本发明提供的酰胺酶的最适ph为8.0，最适温度为30℃。

9、本领域普通技术人员根据本发明提供的酰胺酶及其突变体的氨基酸序列，可以方便地进行重组获得基因工程菌，以基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液或者纯化后的酶液作为酶源。

10、本发明的副球菌来源的酰胺酶及其突变体的有益效果为：

11、本发明利用生物信息学技术从前期研究得到的副球菌paracoccus sp.kdspl-02中挖掘得到酰胺酶的编码基因，提供了一种新的来源于副球菌中的酰胺酶pa404w，本发明seq id no.1(其氨基酸序列)所示的酶与已完成功能鉴定的酶的最高同源性低于50％，序列具有新颖性，氨基酸组成具有独特性。本发明在此基础上，对其位点进行改造，获得催化效率提高的突变体pm-f274a、pm-f274a/w404g。

12、本发明将上述序列成功克隆至大肠杆菌中，对重组菌株进行优化，得到高表达副球菌酰胺酶的工程菌株，为该酶的工业大规模生产提供一种技术思路。以往对该酶的使用局限于半合成抗生素工业，本发明所述酰胺酶及其突变体可用于抗生素降解等环境保护领域。本发明中的副球菌来源的酰胺酶及其突变体在工业领域均具有潜在的应用价值。

技术特征：

1.一种副球菌来源的酰胺酶，其特征在于，所述酰胺酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述副球菌为副球菌paracoccus sp.kdspl-02。

2.一种副球菌来源的酰胺酶的突变体，其特征在于，所述突变体是由seq id no.1所示的氨基酸序列第274位、404位进行定点突变获得。

3.如权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体选自下列之一：

4.编码权利要求1-3任一项所述的酰胺酶或其突变体的基因。

5.包含权利要求4所述的酰胺酶或其突变体的编码基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体使用的质粒为经改造的pgex-6p-1质粒，所述改造为由原有的氨苄西林抗性改造为卡那霉素抗性。

6.如权利要求5所述的重组表达载体构建的含有所述的酰胺酶或其突变体的编码基因的重组基因工程菌，其特征在于，所述的重组基因工程菌是将目的基因与权利要求5所述的重组表达载体构建表达并将其转入到大肠杆菌中得到。

7.一种副球菌来源的酰胺酶或其突变体在催化青霉素水解及阿莫西林合成中的应用。

技术总结本发明公开了一种源自于副球菌Paracoccussp.KDSPL‑02的酰胺酶及其突变体，属于生物化学与酶催化技术领域，所述野生型酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述酰胺酶突变体Pm‑F274A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述酰胺酶突变体Pm‑F274A/W404G的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了所述的酰胺酶及其突变体的催化性能，该酶能够高效催化青霉素G等常见抗生素水解和半合成抗生素的合成。技术研发人员：沈辰,刘守信,丛芹芹,刘紫萌受保护的技术使用者：河北科技大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18