环状肽的制作方法

专利名称：环状肽的制作方法技术领域：本发明是关于通式Ⅰ表示的新环状肽及它们的盐环-(A-B-C-D-Arg) (Ⅰ)其中A和B各自为Ala，Asn，Asp，Arg，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，C 为Asp或Asp(O-C1-4烷基)，D 为Gly或Ala，上述氨基酸残基中至少两种是以D-构型出现。相似化合物可从Pharmazie 40(8)，532-5，(1985)中找到。本发明的目的是寻找具有有用特性，特别是可用于药物制剂的新化合物。通式Ⅰ的化合物及它们的盐被发现具有非常有用的特性。特别是作为整合蛋白(integrin)抑制剂，它们特异性也抑制整合蛋白-β3受体与配体的相互作用。这种作用可以用如J.W.Smith等在J.Bi-ol.Chem.265，12267-12271(1990)中的方法说明。另外，它们还具有抗炎作用。所有这些作用都可用文献中的已知方法说明。这些化合物可作为药理活性物质用于人用药及兽药中，特别是可预防和治疗循环系统疾病如血栓形成、心肌梗塞、动脉硬化、炎症、中风、心绞痛、肿瘤、及骨生成疾病，特别是骨质疏松、血管生成及血管形成术后的再狭窄。上述或下文中氨基酸残基的缩写为以下氨基酸的残基Ala 丙氨酸Asn 天冬酰胺Asp(OR) 天冬氨酸(β-酯)Arg 精氨酸Cys 半胱氨酸Gln 谷氨酰胺Glu 谷氨酸Gly 甘氨酸His 组氨酸Ile 异亮氨酸Leu 亮氨酸Lys 赖氨酸Met 蛋氨酸Phe 苯丙氨酸Pro 脯氨酸Ser 丝氨酸Thr 苏氨酸Trp 色氨酸Tyr 酪氨酸Val 缬氨酸另外，下列缩写代表BOC 叔丁氧羰基CBZ 苄氧羰基DCCI 二环己基碳二亚胺DMF 二甲基甲酰胺EDCI N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基))-碳二亚胺盐酸盐Et 乙基FMOC 9-芴基甲氧羰基HOBt 1-羟基苯并三唑Me 甲基Mtr 4-甲氧-2，3，6-三甲苯磺酰基OBut 叔丁酯OMe 甲酯OEt 乙酯POA 苯氧乙酰基TFA 三氟乙酸如果上述氨基酸存在几种对映体，则上文或下文中指所有对映体或它们的混合物(如DL-构型)，例如作为通式Ⅰ的组成部分时即如此。本发明还涉及通式Ⅰ的化合物或它的盐的制备方法，其特征在于从它的功能团衍生物经溶剂溶解或氢解处理得到;或通过Ⅱ的肽或其活性衍生物用环化剂处理;H-Z-OH Ⅱ其中Z为A-B-C-D-Arg-，-B-C-D-Arg-A-，-C-D-Arg-A-B-，-D-Arg-A-B-C-或-Arg-A-B-C-D-，和/或式Ⅰ的碱性或酸性化合物用酸或碱处理，转变为它的盐。上述及下述残基A、B、C、D及Z如没有特别说明同式Ⅰ和Ⅱ中定义。在上述通式中，烷基优选甲基、乙基、异丙基或叔丁基。基团A优选Val，尤其是D-Val。B优选Phe，尤其是D-Phe。C优选Asp，尤其是D-Asp。D优选Gly。相应地，本发明特别关于式Ⅰ中至少一种残基为上述优选基团时的化合物。一组优选化合物可用式Ⅰa来表达，它对应于式Ⅰ，但其中A 为D-ValB 为PheC 为AspD 为Gly或Ala式Ⅰ的化合物及用来制备它们的前体物质也可以按文献〔如经典著作Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie，(有机化学方法)Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart〕方法制备，特别是在已知反应条件适应所说反应时。在此情形下，也可以利用在此没有详细提到的其它已知方法。前体物质必要时可以现场制备，但不必从反应混合物中分离，立即进行下一步反应，生成式Ⅰ化合物。式Ⅰ的化合物可通过其功能团衍生物溶剂解(特别是水解)或氢解后释放而得到。作为溶剂解或氢解反应的前体物质优选那些含有适当保护基的氨基和/或羟基而非游离氨基和/或羟基的化合物，优选与N原子相连为氨基保护基而非H原子，例如式Ⅰ中含NHR′基团(其中R′为氨基保护基，如BOC或CBZ)而非NH2的相应化合物。另外，前体物质优选那些用羟基保护基代替H原子的化合物，例如式Ⅰ中含R″O-苯基(其中R″为羟基保护基)而非羟基苯基的相应化合物。一个前体物质分子中可含几个相同或不同的被保护氨基和/或羟基。如果保护基互不相同，在许多情况下它们可以被选择性地去除。“氨基保护基”一般为已知，指用来保护氨基不受(阻止)化学反应的影响，但在分子中其它位置的预期反应完成后又易于去除的基团。典型的这类基团特别指饱和或不饱和的酰基、芳基、芳基烷氧甲基或芳烷基。因为预期反应完成后，要脱除氨基保护基，所以它的性质和大小并不关键，但优选含1-20个碳原子，尤其含1-8个碳原子的基团。“酰基”在有关此步骤中指它最宽的含义。它包括衍生自脂肪、芳脂、芳香或杂环羧酸或磺酸的酰基，特别是烷氧羰基、芳氧羰基，尤其是芳烷氧羰基。各类酰基举例如下链烷羰基如乙酰基、丙酰基或丁酰基;芳烷羰基如苯乙酰基;芳酰基如苯甲酰基或甲苯甲酰基;芳氧烷羰基如POA;烷氧羰基如甲氧羰基，乙氧羰基，2，2，2-三氯乙氧羰基、BOC、2-碘乙氧羰基;芳烷氧羰基如CBZ(“苄氧羰基”)、4-甲氧苯甲氧基羰基、FMOC、及芳磺酰基如Mtr。氨基保护基优选BOC和Mtr，另外还有CBZ、FMOC、苄基及乙酰基。“羟基保护基”一般也为已知，指适于保护羟基不受化学反应影响，但在分子中其它位置预期反应完成后易于去除的基团。典型的上述基团为取代或无取代的芳基、芳烷基或酰基，此外还有烷基。由于预期反应后要被去除，所以它们的大小和性质并不关键，但优选含1-20(尤其1-10)个碳原子的基团。羟基保护基例举如下特别是苄基、对硝基苯甲酰基、对甲苯磺酰基及乙酰基，苄基和乙酰基尤为优选。天冬氨酸及谷氨酸的COOH优选用它们的叔丁酯的形式保护〔如Asp(OBut)〕。作为前体物质的式Ⅰ化合物功能团衍生物可用经典著作及提到的专利申请等中描述的常规氨基酸和肽的合成方法来制备，也可以用梅里菲尔德(Merrifield)固相方法〔B.F.Gysin及R.B.Merri-field，J.Am.Chem.Soc.94，3102及以下各页(1972)〕。从其前体中释放出式Ⅰ的化合物是依据所采用保护基团用强酸完成的，优选TFA或高氯酸，但也可以用其它强无机酸如盐酸或硫酸，或强有机羧酸如三氯乙酸，或磺酸如苯磺酸或对甲苯磺酸。也可出现别的惰性溶剂，但不是总需要。合适的惰性溶剂优选有机溶剂，例如羧酸类如乙酸，醚类如四氢呋喃或二噁烷，酰胺类如DMF，卤代碳氢化合物如二氯甲烷，另外醇类如甲醇、乙醇、异丙醇以及水。另外，上述溶剂的混合物也适用。优选使用过量TFA，而无需加别的溶剂，高氯酸以乙酸和70%高氯酸9∶1的形式使用。裂解反应温度优选0°-50℃，尤为15°-30℃(室温)最佳。BOC、OBut及Mtr基团的去除优选用TFA在二氯甲烷中或3-5N HCl在二噁烷中于15-30℃处理，FMOC基团选用5-50%的二甲胺、二乙胺或哌啶在DMF中的溶液于15-30℃处理。可用氢解除去的保护基(如CBZ或苄基)可在催化剂(如常用金属催化剂钯，优选碳为载体)存在下用氢气处理而除去。此时适用的溶剂为上文提及的溶剂，特别是醇类如甲醇或乙醇，或酰胺类如DMF。氢解原则上是在温度0-100℃压力1-200巴，优选20-30℃及1-10巴条件下完成。CBZ基团的氢解用甲醇中5-10%Pd-C或甲醇/DMF中Pd-C上于20-30℃用甲酸铵(而非H2)处理很容易完成。式Ⅰ的化合物也可以用式Ⅱ的化合物在合成肽的条件下环化得到。在此情况下，反应优选常规的肽合成方法来完成，例如Houben-Weyl，loc cit.volume 15/Ⅱ，1-806页(1974)中描述的方法。反应优选在脱水剂存在下，如碳化二亚胺如DCCI或EDCI，另外还有丙烷膦酸酐(对照Angew、Chem.92，129(1980))、二苯膦酰叠氮或2-乙氧-N-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉，在惰性溶剂中，如醚类如四氢呋喃或二噁烷，酰胺类如DMF或二甲乙酰胺，腈类如乙腈或这些溶剂的混合物，温度在-10-40℃优选0-30℃的条件下进行。为了促进在分子间肽键形成前进行分子内环合，优选在稀溶液中反应(稀释原则)。像中间反应活性基团为保护基保护的合适的活性衍生物可代替Ⅱ用于此反应。氨基酸衍生物Ⅱ可以如它们的活化酯的形式被使用，这种酯优选加入和HOBt或N-羟基琥珀酰亚胺就地制备。式Ⅱ的前体物质一般为新化合物。它们可用如上提到的合成肽及去保护基等已知方法来制备。一般首先合成式R′-Z-OR″的保护的五肽酯如，BOC-Z-OMe或BOC-Z-OEt，然后先水解生成式R′-Z-OH的酸，如BOC-Z-OH;再通过去保护基R′生成游离肽H-Z-OH(Ⅱ)。式Ⅰ的碱可用酸转化成适当的酸加成盐。对本反应适合的酸尤指那些能生成生理用盐的酸。因此无机酸可被使用，例如硫酸、硝酸、氢卤酸如盐酸或氢溴酸、磷酸如正磷酸及氨基磺酸，另外可用有机酸，特别是脂肪、脂环、芳脂、芳香或杂环的一元或多元羧酸、磺酸或硫酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、苯甲酸、水杨酸、2-或3-苯丙酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲或乙磺酸、乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘单磺酸、萘二磺酸及月桂硫酸。含有生理用酸如苦味酸的盐可用于分离及/或纯化式Ⅰ的化合物。另一方面，式Ⅰ的酸也可以用碱转化成生理可用的金属盐或铵盐。在此适合的盐尤指钠盐、钾盐、镁盐、钙盐及铵盐，以及取代的胺盐，如二甲基、二乙基或二异丙基胺盐、单乙醇胺盐、二乙醇胺盐或三乙醇胺盐、环己基胺盐、二环己基胺盐、二苄基乙二胺盐。还有与N-甲基-D-葡糖胺、精氨酸或赖氨酸所成的盐。式Ⅰ的新化合物和它们的生理用盐可同至少一种赋形剂或添加剂，必要时与一种或多种其它活性化合物一起制成适当的剂型用于药物制剂产品中。这样得到的制剂可用作人体或兽用的药物。合适的赋形物为适于胃肠道(如口服或直肠给药)、非肠道(如静脉注射)或局部(如局部、皮肤、眼内或鼻内给药)给药或气雾吸入剂形式给药的且不与新化合物发生反应的有机或无机物质，例如水或等渗盐水溶液、低级醇、植物油、苯甲醇、聚乙烯乙二醇、甘油三乙酸酯及其它脂肪酸甘油酯、明胶、大豆卵磷脂、碳水化合物如乳糖或淀粉、硬脂酸镁、滑石、纤维素及凡士林。片剂、包衣片剂、胶囊、糖浆、液态或滴剂特别用于口服给药;具有抗胃液的膜或胶囊外壳的薄膜片剂和胶囊特别有意义。栓剂被用作直肠给药;溶液，优选油或水溶液，还有混悬液、乳剂或植入物被用作非肠道给药。溶液(比如可以滴眼液形式使用)以及如混悬液、乳剂、乳膏、软膏或敷布等适于局部应用。喷雾剂为活性物质溶于或悬于一种推进气体或推进气体混合物(如CO2或氯氟烃)中可作为吸入喷雾给药。此时活性物质优选用微粒化形式，可能同时存在一种或多种生理耐受溶剂如乙醇。吸入溶液可以借助于常规吸入器投药。这些新化合物可被冷冻干燥，所得冷干品可用作如注射制剂。注射剂可以用大团剂或连续输入(如静脉、肌内、皮下或鞘内)的方法给药。所指制剂可消毒和/或有赋形剂如防腐剂、稳定剂和/或润湿剂、乳化剂、影响表面张力的盐、缓冲物质、着色剂及/或调味剂。如有必要，这些制剂中可含一种或多种其它活性化合物，如一种或多种维生素。本发明的物质一般可与其它已知市售肽类类似给药，尤其类似于US-A-4，472，305中描述的化合物，优选剂量为每剂量单位从0.05到500mg，尤其优选0.5-100mg。日剂量根据体重优选0.01-2mg/kg。但对每个预期的病人的特异剂量依赖于许多不同因素如所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、费用、给药时间和途径、排泄率、药物结合率及所治疗具体疾病的严重程度。优选肠胃外给药。上述或下述的所有温度都指℃。在下列实施例中，“常规操作”指需要时加水，混合液调至中性后用乙醚或二氯甲烷提取，分出有机层，用硫酸钠干燥、过滤再蒸发，残余物用硅胶色谱法和/或结晶方法纯化。RT＝HPLC在Lichrosorb RP select B(250-4.7μm)柱上的保留时间(分)，洗脱液含0.3%TFA的水中0-80体积%的异丙醇梯度，流速1ml/min，215nm下检测，时间50分钟。M+＝FAB法所得质谱中的分子离子峰。实施例1含30mg环-(D-Val-L-Phe-D-Asp(OBut)-Gly-D-Arg(Mtr))〔按实施例2的方法将H-D-Arg(Mtr)-D-Val-L-Phe-D-Asp(OBut)-Gly-OH环化后所得〕及840μl TFA、170μl二氯甲烷和85μl硫代苯酚的溶液在20°下静置2小时，37°下减压浓缩，再用水洗释后冷冻干燥。在用乙酸/水1∶1洗脱的Sephadex G10上凝胶过滤后，随后用LiChrosorb RP8柱进行制备性HPLC纯化，0.3%TFA/水中异丙醇梯度洗脱，得到环-(D-Val-L-Phe-D-Asp-Gly-D-Arg)，RT17.9;M+575。用类似方法得到下列物质环-(D-Val-D-Phe-D-Asp-Gly-D-Arg)，RT 18.5;M+575;从 环-(D-Val-D-Phe-L-Asp(OBut)-Gly-D-Arg(Mtr))环-(D-Val-D-Phe-L-Asp-Gly-D-Arg)，RT19.3;M+575;从 环-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OBut)-L-Ala-D-Arg(Mtr))环-(D-Val-D-Phe-D-Asp-L-Ala-D-Arg)，RT20.3;M+589;从 环-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OBut)-Gly-D-Arg(Mtr))从 环-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OMe)-Gly-L-Arg(Mtr))环-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OMe)-Gly-L-Arg)，RT21.4;M+589;从 环-(D-Val-D-Phe-L-Asp(OBut)-Gly-L-Arg(Mtr))环-(D-Val-D-Phe-L-Asp-Gly-L-Arg)从 环-(L-Val-D-Phe-D-Asp(OBut)-Gly-L-Arg(Mtr))环-(L-Val-D-Phe-D-Asp-Gly-L-Arg);从 环-(D-Val-L-Phe-D-Asp(OBut)-Gly-L-Arg(Mtr))环-(D-Val-L-Phe-D-Asp-Gly-L-Arg);从 环(L-Val-D-Phe-L-Asp(OBut)-Gly-D-Arg(Mtr))环-(L-Val-D-Phe-L-Asp-Gly-D-Arg)从 环-(D-Val-L-Phe-L-Asp(OBut)-Gly-D-Arg(Mtr))环-(D-Val-L-Phe-L-Asp-Gly-D-Arg);从 环-(L-Val-L-Phe-D-Asp(Obut)-Gly-D-Arg(Mtr))环-(L-Val-L-Phe-D-Asp-Gly-D-Arg);从 环-(L-Val-D-Phe-L-Asp(OBut)-D-Ala-L-Arg(Mtr))环-(L-Val-D-Phe-L-Asp-D-Ala-L-Arg);从 环-(D-Val-L-Phe-L-Asp(OBut)-D-Ala-L-Arg(Mtr))环-(D-Val-L-Phe-L-Asp-D-Ala-L-Arg);从 环-(L-Val-L-Phe-D-Asp(OBut)-D-Ala-L-Arg(Mtr))环-(L-Val-L-Phe-D-Asp-D-Ala-L-Arg);从 环-(L-Val-L-Phe-L-Asp(OBut)-D-Ala-D-Arg(Mtr))环-(L-Val-L-Phe-L-Asp-D-Ala-D-Arg).实施例2含80mg H-L-Arg-D-Val-D-Phe-D-Asp(OMe)-Gly-ONa〔从FMOC-L-Arg-D-Val-D-Phe-D-Asp(OMe)-Gly-O-Wang用吗啉消除FMOC基团(其中O-Wang为梅里菲尔德合成中以1%的对二乙烯基苯交联的-4-氧甲基苯氧甲基聚苯乙烯)，用TFA/二氯甲烷将五肽从聚合物上消除下来而得〕的8ml DMF溶液用72ml二氯甲烷稀释，再用34mg NaH-CO3细粉处理。在干冰/丙酮中冷却后，加入34μl的二苯基膦酰叠氮。在20°放置16小时后，37°下除去二氯甲烷。残余溶液经凝胶过滤后(Sephadex G10柱，异丙醇/水8∶2洗脱)用聚合物柱(Mit-subishi MCI CHP-20P)在水中异丙醇梯度洗脱条件下进行色谱分离。得到环-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OMe)-Gly-L-Arg)，RT21.4;M+589。以下实施例是关于药物制剂实施例A注射小瓶将含100g式Ⅰ的一种环肽和5g磷酸氢二钠及3l双蒸水的溶液用2N盐酸调至pH6.5，无菌过滤，在无菌条件下注入小瓶并冷冻干燥，以无菌方式将小瓶封口。每个注射小瓶含有5mg的活性化合物。实施例B栓剂将20g式Ⅰ的化合物与100g大豆卵磷脂及1400g可可脂混合，再将混合物注入模具并冷却。每个栓剂含20mg活性化合物。实施例C溶液将1g式Ⅰ的活性化合物、9.38g NaH2PO4·2H2O、28.48gNa2HPO4·12H2O及0.1g洁尔灭用940ml双蒸水制成溶剂。调溶液pH至6.8，体积达1l，照射灭菌。此溶液可以滴眼形式使用。实施例D软膏500mg式Ⅰ的活性化合物在无菌条件下与99.5g石油凝胶混合。实施例E片剂由100g式Ⅰ的一种环状肽、1kg乳糖、600g微晶纤维素、600g玉米淀粉、100g聚乙烯吡啶烷酮、80g滑石及10g硬脂酸镁组成的混合物用常规方法压制成片剂，这样每片含10mg活性化合物。实施例F包衣片剂按实施例E的方法压制片剂，然后用常规方法包上蔗糖、玉米淀粉、滑石、黄蓍胶及着色剂的膜。实施例G胶囊用常规方法向硬明胶胶囊中装入式Ⅰ的活性化合物，使每粒胶囊中含5mg活性化合物。实施例H吸入喷雾剂将14g式Ⅰ的活性化合物溶于10l的NaCl等渗溶液中并将此溶液装入市售的具有泵装置的喷雾器中。此溶液可被喷到嘴或鼻中。喷射一次(大约0.1ml)相当于0.14mg剂量。权利要求1.式Ⅰ的环状肽及它们的盐环-(A-B-C-D-Arg) (Ⅰ)其中A和B各自为Ala，Asn，Asp，Arg，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val，C为Asp或Asp(O-C1-4烷基)，D为Gly或Ala，上述氨基酸残基中至少两种是以D-构型出现。2.环-(D-Val-L-Phe-D-Asp-Gly-D-Arg)。3.环-(D-Val-D-Phe-D-Asp-Gly-L-Arg)。4.环-(D-Val-D-Phe-L-Asp-Gly-D-Arg)。5.环-(D-Val-D-Phe-D-Asp-L-Ala-D-Arg)。6.环-(D-Val-D-Phe-D-Asp(OMe)-Gly-L-Arg)。7.权利要求1中式Ⅰ的化合物或它的盐的制备方法，其特征在于这些化合物是从它们的功能团衍生物通过溶剂解或氢解试剂处理而释放得到;或在于通式Ⅱ的肽H-Z-OH Ⅱ其中Z为其中A-B-C-D-Arg-，-B-C-D-Arg-A-，-C-D-Arg-A-B-，-D-Arg-A-B-C-或-Arg-A-B-C-D-，或这种肽的活性衍生物用环化剂处理，和/或在于式Ⅰ的碱性或酸性化合物用酸或碱处理转化为它的盐。8.药物制剂的制备方法，其特征在于权利要求1中式Ⅰ的化合物和/或它的生理用盐与至少一种固态、液态或半固态的赋形剂或佐剂一起制成适当的剂型。9.药物制剂，其特征在于它含有至少一种权利要求1中通式Ⅰ的化合物和/或它的生理用盐。10.权利要求1中式Ⅰ的化合物或它们的生理用盐的药物生产的用途。11.权利要求1中式Ⅰ的化合物或它们的生理用盐在控制疾病中的用途。全文摘要本发明是关于通式I的新的环状肽和它们的盐环—(A-B-C-D-Arg) (1)其中A和B各自为Ala，Asn，Asp，Arg，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Scr，Thr，Trp，Tyr或Val，C为Asp或Asp(O-C这些化合物作为整合蛋白抑制剂可被特别用于预防及治疗循环系统疾病及肿瘤治疗。文档编号C07K7/64GK1093090SQ9311422公开日1994年10月5日 申请日期1993年11月5日 优先权日1992年11月6日发明者A·琼可兹克, G·霍尔兹曼, B·F-哈伯曼, F·里佩曼, G·梅尔泽, B·迪芬巴赫, H·凯斯勤, R·豪伯纳, J·沃姆萨 申请人:默克专利股份有限公司