ARC微生物菌剂用于生产ARC+根瘤菌肥（剂）的用途

本发明属于微生物领域，也属于作物肥料领域，具体涉及arc微生物菌剂用于生产arc+根瘤菌肥(剂)的用途。

背景技术：

1、大豆花生产业发展面临两大共性难题：一是花生、大豆易受剧毒、强致癌性黄曲霉毒素污染，不仅降低质量、损失产量，还严重威胁人民生命健康。花生黄曲霉毒素污染是花生等产业主要风险因子。现有花生、大豆黄曲霉毒素阻控方法主要是在收储、运输、加工环节，靠调温调湿，能耗高、防控难，黄曲霉毒素污染防控一直是世界性难题。

2、二是大豆和花生等豆科作物，虽有与土壤根瘤菌共生结瘤固氮习性，但自然状态下根瘤数量少，固氮时间短(通常认为播种后作物生长第一月不会结瘤固氮，鼓荚或饱果期时不再有新生根瘤，且已有根瘤开始逐渐衰败)、效率低。根瘤菌生物固氮研究已有100多年历史，形成了经典公认的aon理论体系——植物自调控结瘤数量和生长量，并维持总能量守恒，如果要过多的结瘤，那么必然以牺牲植物生长量为代价，现有做法主要是通过筛选和施用适合相应产地环境的优良根瘤菌，在应用上具地域局限性，长期受到aon理论束缚，结瘤固氮效率提升有限，较好的提高约30％左右，难以实现结瘤固氮效率翻番式提升的同时生长量也显著增加(打破aon理论体系)。如何提高花生、大豆等豆科作物结瘤固氮效率同样是国际热点前沿难题。

3、针对上述难题，发明人团队历经20多年持续研究，探明了黄曲霉产毒菌丰度与产毒力、地理、气候等53个因素与黄曲霉毒素发生的时空关联，创建了高灵敏检测与预警技术，明确了黄曲霉毒素污染源头在土壤，构建了黄曲霉毒素产毒菌株库，首次提出黄曲霉毒素土壤源头阻控与结瘤固氮耦合的科学设想。通过解析花生根际根内微生物种群结构，分离鉴定并构建益生菌菌株资源库，组配海量组合，完成了实验室和大田筛选鉴定，开启了土壤源头黄曲霉毒素阻控和诱导结瘤固氮耦合的研究探索。近五年成功研制出arc微生物菌剂，实现了黄曲霉毒素源头绿色阻控的同时诱导促进大豆花生高效结瘤固氮和极显著增产，具备这样功能的微生物菌剂被称为arc微生物菌剂或arc菌剂，arc全称aspergillusflavus/aflatoxins and rhizobia coupling，即对阻控黄曲霉及其毒素污染和促进结瘤固氮起耦合作用。该类菌剂应用简便、成本低、效益高，具有两固(固氮固碳)、三增(增产增效增安全)、五减(减毒减损减肥减本减碳)的显著特点和巨大应用潜力，已经经过了全国多点大豆、花生、豌豆等豆科作物主产区大田生产试验示范与验证。对推动我国大豆油料产能提升和绿色低碳高效生产具有重大意义。

4、根瘤菌剂，也有称之为根瘤菌肥，是指以根瘤菌为生产菌种制成的微生物制剂产品。根瘤菌肥(剂)具有与豆科作物共生固氮的习性与应用潜力，将固定空气中的氮气转化为宿主植物能够吸收利用氮肥，从而达到增产的目的。发明人团队进一步研究发现，arc微生物菌剂与根瘤菌肥(剂)经复配制备成arc+根瘤菌肥(剂)后，应用在大豆、花生等豆科作物生产上，arc+根瘤菌肥(剂)对大豆、花生等豆科仍具有arc微生物菌剂作用，由此发明了arc微生物菌剂用于生产arc+根瘤菌肥(剂)的用途，为arc微生物菌剂的推广应用和助推大豆花生等豆科产业发展提供了新方法。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术存在的不足，提供控毒固氮耦合增产arc微生物菌剂，其用于生产arc+根瘤菌肥(剂)的用途，使用简单，社会和生态效益显著，容易推广应用。

2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

3、本发明首先提供了控毒固氮耦合增产arc微生物菌剂，其为微生物菌组合物，具有控毒固氮耦合效应，具有调控提高豆科作物根际根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用，含有如seq id no.1-4所示的dna序列1～4中的全部基因序列。

4、按上述方案，所述的arc微生物菌剂对黄曲霉菌和/或其毒素有抑制作用。进一步地，黄曲霉菌抑菌率可达到60％以上，黄曲霉毒素抑制率达到80％以上。对黄曲霉菌和/或毒素的抑制可使用现有技术其他常规检测方法检测，也可通过对黄曲霉产毒菌标识性分子的抑制分析进行黄曲霉菌和/或其毒素的抑制分析检测。具体地，可通过对黄曲霉产毒菌标识性分子的抑制分析进行arc微生物菌剂对黄曲霉菌和/或其毒素的抑制分析检测。

5、按上述方案，本发明的arc微生物菌剂对黄曲霉pab-01蛋白质的表达量有显著抑制，pab-01蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。抑制率大于90％，优选大于95％，反映出本发明的arc微生物菌剂优异的控菌减毒作用。黄曲霉pab-01蛋白质表达量的抑制率测定方法可参考如下文献的方法，protein biomarker for early diagnosis of microbialtoxin contamination:using aspergillus flavus as an example，foodfrontiers.2023，4，2013-2023，doi:10.1002/fft2.295。

6、按上述方案，优选地，所述的arc微生物菌剂为三种或以上微生物菌的组合。

7、按上述方案，所述的arc微生物菌剂对黄曲霉菌/其毒素具有抑制作用。

8、按上述方案，所述的arc微生物菌剂对青霉菌、黄曲霉以外曲霉菌、镰刀菌、齐整小核菌、青枯假单胞杆菌、疫霉、核盘菌、腐霉菌、丝核菌等土传植物病原菌中的一种或多种病原菌(致病因子)/毒素具有抑制作用。

9、按上述方案，所述arc微生物菌剂能够促进豆科作物如花生、大豆早结瘤、延长结瘤固氮时间。

10、seq id no.1-4所示的dna序列基因在不同菌株中可能会有一定程度的变异，在变异程度较小，比如不超过10％的碱基变异，优选不超过5％的碱基变异，更优选不超过1％的碱基变异，即同一性90％以上，优选95％以上，更优选99％以上，并具有相应的生物活性功能的情况下，这些称为seq id no.1-4所示的dna序列的功能等价物，含有这些序列等同于含有dna序列1～4的相应序列。微生物菌组合物含有seq id no.1～4所示的dna序列或其功能等价物，并具有控毒固氮耦合作用，具有调控提高豆科作物根际的根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用的情况下，均为本发明的arc微生物菌剂。

11、上述dna序列1～4是经过与genbank基因组大数据比对后获得的特异性序列，其与本专利微生物菌剂的作用功能有着直接或间接的相关性，含有上述dna序列1-4的全部基因序列时，具有控毒固氮耦合效应，具有调控提高豆科作物根际根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用，为本发明的arc微生物菌剂。这些基因在不同菌株中可能会有一定程度的变异，在差异程度较小，比如不超过10％的碱基变异，并能保持相应的生物活性功能的情况下，含有它们等同于含有如seq id no.1-4所示的基因序列。

12、按上述方案，优选地，上述arc微生物菌剂可以是但不限于如下4株微生物的组合物：保藏编号为cctcc no:m 20231815的侧孢芽孢杆菌、保藏编号为cctcc no:m 20231598的解淀粉芽孢杆菌、保藏编号为cctcc no:m 20231817的胶质芽孢杆菌、保藏编号为cctccno:m 20231595的路德维希肠杆菌。

13、侧孢芽孢杆菌h-cb4802，保藏日期为2023年9月27日，保藏编号为cctcc no:m20231815，分类命名为：brevibacillus laterosporus strain h-cb4802，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学。

14、解淀粉芽孢杆菌ar1004，保藏日期为2023年9月4日，保藏编号为cctcc no:m20231598，分类命名为：bacillus amylolyticus ar1004，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学。

15、胶质芽孢杆菌jz2013，保藏日期为2023年9月27日，保藏编号为cctcc no:m20231817，分类命名为：bacillus mucilaginosus strain jz2013，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学。

16、路德维希肠杆菌ar1001，保藏日期为2023年9月4日，保藏编号为cctcc no:m20231595，分类命名为：enterobacter ludwigii ar1001，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学。

17、按上述方案，优选地，上述arc微生物菌剂可以是保藏编号为cctcc no:m20231815的侧孢芽孢杆菌、保藏编号为cctcc no:m 20231598的解淀粉芽孢杆菌、保藏编号为cctccno:m 20231817的胶质芽孢杆菌、保藏编号为cctcc no:m 20231595的路德维希肠杆菌中一株以上的微生物和其他微生物的组合，使得组合后微生物菌剂满足含有如seq id no.1～4所示的核苷酸序列中的全部基因序列或其功能等价物，具有控毒固氮耦合作用，具有调控提高豆科作物根际的根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用，构成本发明的arc微生物菌剂。

18、按上述方案，上述微生物菌剂中，任意一种菌株在微生物菌剂即混合形成的微生物菌组合物中的活菌数比例大于等于1％。

19、本发明的arc微生物菌剂为微生物菌组合物，通过微生物菌组合物中的各组配微生物协同作用产生控毒固氮耦合效应，发挥控毒和固氮的耦合效果，用于作物生产具有控毒固氮耦合效应，对阻控黄曲霉及其毒素污染和促进结瘤固氮起耦合作用，具有调控提高豆科作物根际根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量的作用；其自身不是根瘤菌，但能够调控提高豆科作物根际根瘤菌丰度、增加豆科作物结瘤数量，提高单株固氮酶活性，其提高豆科作物根际的根瘤菌丰度至少可达到15％以上，结瘤数量倍数增加可达2倍以上；能够促进花生、大豆早结瘤、延长结瘤固氮时间。

20、上述arc微生物菌剂可以通过如下方法制备获得，采用组配上述微生物菌剂中的微生物，经发酵途径制备获得。上述发酵途径，可以采用现有技术包括现有文献等记载的已经公开的细菌的常规发酵途径。

21、上述arc微生物菌剂在豆科作物生产上可以有如下用途：用于提升豆科作物产品的品质与安全水平；用于促进豆科作物结瘤固氮；用于提高豆科作物单产水平；用于招募土著根瘤菌，提高豆科作物根根际土壤根瘤菌丰度；促进豆科作物提早结瘤并延长结瘤固氮时间；用于防止豆科作物成熟期脱肥早衰；用于增加豆科作物荚果数量；用于增加豆科作物荚果饱满度，降低瘪荚率；用于促进豆科作物提前开花、提早结荚；用于减轻花生果腐病发生；用于减轻豆科作物青枯病发生；用于减轻豆科作物白粉病发生；用于减轻豆科作物叶斑病发生；用于减轻豆科作物根部线虫病发生；用于减轻豆科作物根腐病发生；用于减轻豆科作物根部线虫病发生；用于减轻豆科作物疫霉病发生；用于减轻豆科作物菌核病发生；用于减轻豆科作物霜霉病发生；用于减轻豆科作物枯萎病发生；用于减轻豆科作物白绢病发生；用于减轻大豆症青发生程度；用于减轻玉米穗腐病与镰刀菌毒素发生程度；用于降低小麦赤霉病菌丰度与减轻赤霉毒素发生程度；用于促进豆科作物碳减排，有利于土壤改良；用于促进豆科作物总生物量提高；用于降低豆科作物根际土曲霉菌、镰刀菌等有害生物丰度，有利于改良土壤微生物种群结构；用于减轻花生果表面斑点，增加商品性；用于促进盐碱地大豆增产。

22、更具体地，可有如下用途：

23、arc微生物菌剂用于提高花生品质与质量安全及减少损失的用途

24、arc微生物菌剂用于促使花生结瘤固氮实现绿色低碳生产的用途

25、arc微生物菌剂用于提高花生单产水平和总生物量的用途

26、arc微生物菌剂用于花生延长结瘤固氮时间防止脱肥早衰的用途

27、arc微生物菌剂用于花生提早结瘤固氮和提前开花、下针、坐果的用途

28、arc微生物菌剂用于提高花生果饱果率、增加荚果数的用途

29、arc微生物菌剂用于减轻花生果腐病、白绢病、根腐病等真菌性病害及其危害的用途

30、arc微生物菌剂用于减轻花生青枯病等细菌性病害及其危害的用途

31、arc微生物菌剂用于减轻花生根结线虫病及危害的用途

32、arc微生物菌剂用于减轻花生果表面霉斑点等斑点提高商品性的用途

33、arc微生物菌剂用于提高大豆品质和降低黄曲霉毒素污染风险的用途

34、arc微生物菌剂用于促进大豆结瘤固氮实现绿色低碳生产的用途

35、arc微生物菌剂用于提高大豆单产水平和总生物量的用途

36、arc微生物菌剂用于大豆延长结瘤固氮时间防止脱肥早衰的用途

37、arc微生物菌剂用于大豆提早结瘤固氮、提前开花与结荚的用途

38、arc微生物菌剂用于减少大豆瘪荚率和提高大豆荚果饱满度的用途

39、arc微生物菌剂用于减轻大豆症青及其危害的用途

40、arc微生物菌剂用于减轻大豆白粉病、霜霉病等真菌性病害及危害的用途

41、arc微生物菌剂用于减轻大豆根腐病及危害的用途

42、arc微生物菌剂用于缩短大豆结间距和增加结荚数量的用途

43、arc微生物菌剂用于提高盐碱地大豆产量的用途

44、arc微生物菌剂用于促进豆科蔬菜结瘤固氮与提高单产水平的用途

45、arc微生物菌剂用于促进豆科杂粮作物结瘤固氮与提高单产水平的用途

46、arc微生物菌剂用于促进豆科饲草结瘤固氮与提高单产水平的用途

47、arc微生物菌剂用于促进大豆、花生等豆科作物生产碳减排与提高耕地质量的用途

48、arc微生物菌剂用于减轻花生、大豆等豆科作物生产连作重茬危害的用途

49、arc微生物菌剂用于玉米生产控菌减毒提高质量安全水平与减少损失的用途

50、arc微生物菌剂用于小麦生产控菌减毒提高质量安全水平与减少损失的用途。

51、基于该arc微生物菌剂的进一步研究，本发明又提供了arc微生物菌剂用于生产arc+根瘤菌肥(剂)的用途。

52、本发明也提供了arc微生物菌剂与根瘤菌肥(剂)复配生产arc+根瘤菌肥(剂)的方法。

53、上述arc微生物菌剂用于生产arc+根瘤菌肥(剂)，其生产方法可以如下：按照每亩地根瘤菌肥(剂)用量和arc微生物菌剂不低于800亿活菌数的用量，将根瘤菌肥(剂)和arc微生物菌剂进行配比，再通过常规物理掺混，将arc微生物菌剂和根瘤菌肥(剂)混匀，即配置成arc+根瘤菌肥(剂)。

54、上述arc微生物菌剂用于生产arc+根瘤菌肥(剂)，其生产方法也可以如下：按照每亩地根瘤菌肥(剂)用量和arc微生物菌剂不低于800亿活菌数的用量，将根瘤菌肥(剂)的菌液/菌粉和arc微生物菌剂的菌液/菌粉进行配比，再通过常规物理均匀混合，再采用物理方法吸附到载体上制备成arc+根瘤菌肥(剂)。

55、按上述方案，上述根瘤菌肥(剂)、根瘤菌菌液、根瘤菌菌粉，可以从市场购买获得，也可以通过常规方法从豆科作物根瘤中分离鉴定筛选并发酵制备获得。

56、上述物理方法可以采用喷枪将液体状态的arc微生物菌剂的菌液和根瘤菌肥(剂)的菌液组成的混合菌液或者干粉状态的arc微生物菌剂的菌粉和根瘤菌肥(剂)的菌粉组成的混合菌粉喷射吸附到载体颗粒上。

57、按上述方案，上述载体可以是碳粉、炭粉、腐殖质、沸石粉、硅藻土、蛭石、膨润土、风化煤等一种或两种及以上混合物。

58、本发明进一步提供了利用上述arc微生物菌剂配制得到的arc+根瘤菌肥(剂)。

59、本发明进一步提供了arc+根瘤菌肥(剂)在作物生产上的应用。

60、按上述方案，所述的作物包括但不限于豆科作物、玉米、小麦。所述的豆科作物包括花生、大豆，以及红小豆、绿豆等豆科杂粮作物，豌豆、蚕豆、豇豆、四季豆、芸豆等豆科蔬菜，苜蓿、紫云英等豆科饲草作物。

61、将上述arc+根瘤菌肥(剂)可以用在花生、大豆等豆科作物和其他作物生产上，同时发挥arc微生物菌剂和根瘤菌肥(剂)的作用。

62、本发明有益效果在于：

63、1.arc微生物菌剂可用于生产arc+根瘤菌肥(剂)的用途，能同时发挥arc微生物菌剂和根瘤菌肥(剂)的作用，既可避免应用田块中根瘤菌缺乏的问题，同时又含有调控根瘤菌并促进根瘤菌结瘤固氮的作用；2.应用简便、成本低、效益高；3.arc+根瘤菌肥(剂)可用在豆科作物生产上，对推动豆科作物产能提升和绿色低碳高效生产具有重大意义。