具有新结构组分的纳米粒疫苗的制作方法

具有新结构组分的纳米粒疫苗1.相关申请的交叉引用2.本专利申请要求美国临时专利申请号62/684,229(2018年6月13日提交；未决)的优先权权益。优先权申请的全部公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。3.政府支持声明4.本发明是在美国国立卫生研究院(the national institutes of health)授予的资助号r01 ai129698-02和r56 ai125078-01的政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。背景技术：5.在设计用于抵抗多种病原体(例如病毒)感染的疫苗方面已经取得了实质性进展。hiv-1疫苗领域中最近建立的合理疫苗设计策略和新技术为其他病毒病原体和非病毒疾病靶标的疫苗开发提供了潜在的解决方案。合理的疫苗设计策略包括广泛中和抗体(bnab)的鉴定、bnab-抗原复合物的结构分析以及基于结构的免疫原设计和测试。在免疫原设计的背景下，在多种病毒包膜(env)蛋白的稳定化和重新设计以及优化env蛋白在病毒样颗粒(vlp)或类似几何形状的纳米粒上的多价展示方面，已经看到了重大突破。由于其大的尺寸和表面抗原的密集展示，vlp可以引发强烈且持久的免疫应答。vlp已被开发为针对同源病毒的成功疫苗(用于人乳头瘤病毒的)或用于外来抗原的运载体。已确定用于b细胞活化的最佳抗原间隔是间隔5至10nm的最少20至25个表位。因此，可以对具有vlp分子特征(球形，10至100个纳米等)的自组装纳米粒进行重新改造以展示多种抗原，以用于开发有效的vlp型疫苗。6.在多种病毒的env蛋白的稳定化和重新设计方面已经取得了重大进展。例如，由于积累了有关bnab和env结构的大量信息，hiv-1疫苗研究现在集中在抗原选择和评价上。由于来自bg505 sosip.664gp140三聚体的有希望的早期数据，因此天然样三聚体已成为理想的疫苗平台。其他gp140设计(例如sc-gp140和nfl)也产生了天然样三聚体。然而，所有这些设计在应用于非bg505 env时在三聚体产量、纯度和稳定性方面具有重大损失，并且需要另外的env稳定化突变和复杂的纯化方法来获得天然样三聚体。直到最近，env亚稳定性的主要原因——gp41胞外域(gp41ecto)中的hr1弯曲(第547至569位氨基酸)——才被确定并通过合理的重新设计直接靶向。所得三聚体构建体被称为“未切割的融合前优化(uncleaved prefusion-optimized，ufo)”设计。最近还证明了gp41ecto是env亚稳定性的唯一来源，并且ufo设计的bg505gp41ecto可用于使多种hiv-1亚型稳定并具有大的三聚体产量、纯度和稳定性，为基于三聚体的hiv-1疫苗设计提供了简单、通用且有效的策略。7.在使用自组装纳米粒展示env抗原作为疫苗候选物方面也取得了重大进展，特别是考虑到对单个抗原观察到的差免疫原性。例如，已在野生型(wt)小鼠、人ig敲入小鼠、兔和非人灵长类动物(nhp)中测试了sosip和nfl的hiv-1三聚体的免疫原性，对于兔和nhp观察到了自体2级nab应答，但是对于wt小鼠则没有。这样的2级nab应答的诱导通常需要6至12个月的免疫接种，表明可溶性三聚体可能不是最佳的疫苗形式。一致地，更近的研究表明，具有固有稳定性和纯度的ufo三聚体可以展示在包括24聚体铁蛋白(fr)、60聚体e2p和60聚体i3-01的三种纳米粒上，并且具有高产量高纯度。参见he et al.，nat.commun.7：12041，2016。这样的纳米粒首次在8周后在小鼠中引发了明显的2级hiv-1中和抗体应答，而所有可溶性三聚体均失败。一种这样的纳米粒在6周后在兔中引发了明显的2级hiv-1中和抗体反应，而可溶性三聚体需要另外8周(在第14周)才能产生这样的应答。参见，he et al.，sci.adv.4(11)：eaau6769，2018。8.尽管在疫苗设计中取得了实质性进展，但在医学领域中仍然需要更有效和强效的疫苗免疫原，例如用于预防多种病毒或非病毒病原体的感染(例如，hiv-1感染)。本发明解决了本领域中未满足的需求。技术实现要素：9.在一方面中，本发明提供了疫苗组合物，其包含(1)展示在自组装纳米粒的表面上的多肽免疫原和(2)嵌入在纳米粒内部并且与自组装纳米粒的亚基连接的锁定结构域(locking domain)。在这些疫苗组合物中，锁定结构域是蛋白质亚基，其可以在溶液中与和附近纳米粒亚基连接的另一锁定结构域通过界面处的非共价相互作用自然形成二聚体。在一些实施方案中，所采用的锁定结构域是与另一相同蛋白质结构域或亚基形成同二聚体的蛋白质结构域或亚基。在这些实施方案中的一些中，所采用的锁定结构域的亚基具有如seq id no：1至9中任一个中所示的氨基酸序列、其保守修饰的变体或实质上相同的序列。10.在本发明的一些疫苗组合物中，锁定结构域与纳米粒的亚基共价连接。在这些实施方案中的一些中，锁定结构域的n末端通过接头序列与纳米粒亚基的c末端融合。本发明的一些疫苗组合物还可以包含泛反应性t细胞表位。在这些实施方案中的一些中，t细胞表位的n末端与锁定结构域的c末端融合。本发明的一些疫苗组合物还可以包含插入在免疫原与纳米粒亚基之间的颈部区域(neck region)。在这些实施方案中，颈部区域可以是3-螺旋蛋白结构域，其将免疫原升高以进一步远离纳米粒的表面。除了从内部使纳米粒稳定的锁定结构域之外，本发明的一些疫苗组合物还可包含插入在免疫原与纳米粒亚基之间的蛋白质结构域，以进一步使免疫原多肽稳定。在一些优选的实施方案中，用于构建本发明的疫苗组合物的纳米粒是具有旋转对称性的球形纳米粒。在这些实施方案中的一些中，旋转对称性具有3次对称轴和/或5次对称轴。在这些实施方案中的一些中，所采用的纳米粒具有二十面体结构。11.在本发明的一些疫苗组合物中，展示在纳米粒上的多肽免疫原是病毒免疫原。在这些实施方案中的一些中，展示的多肽免疫原是来自利用i类融合机制的病毒的病毒免疫原。作为示例，免疫原可来源于hiv-1病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、沙粒病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)和冠状病毒。在另一些实施方案中，展示的多肽免疫原是来自利用ii类融合机制的病毒的病毒免疫原。作为示例，免疫原可来源于hcv或寨卡病毒。在另一些实施方案中，展示的多肽免疫原是非病毒免疫原。作为示例，展示的免疫原可以是来自恶性疟原虫(plasmodium falciparum)的抗原、来自结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，tb)的抗原或人蛋白质前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)。12.本发明的一些疫苗组合物是展示hiv-1env来源的三聚体蛋白的hiv-1疫苗。在这些实施方案中的一些中，锁定结构域的n末端通过包含ggggs(seq id no：17)的一个或更多个串联拷贝的接头序列与纳米粒亚基的c末端融合。在一些实施方案中，疫苗组合物还可以包含泛反应性t细胞表位。在这些实施方案中的一些中，t细胞表位的n末端与锁定结构域的c末端融合。在这些实施方案中的一些中，t细胞表位具有序列akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在一些实施方案中，hiv-1三聚体蛋白的亚基的c末端与纳米粒的亚基的n末端共价连接。在一些实施方案中，hiv-1三聚体蛋白亚基通过接头序列与纳米粒亚基融合。在多种实施方案中，所采用的接头序列可以具有序列(gasb)n，其中a为1至5的整数，b为1至2的整数，并且n为1至5的整数。13.在本发明的一些疫苗组合物中，自组装纳米粒具有形成三聚体的三聚体序列。在这些实施方案中的一些中，自组装纳米粒的亚基是这样的多肽，其具有如seq id no：26(铁蛋白)、seq id no：21(e2p)、seq id no：22(i3-01)或seq id no：25(i3-01变体)中所示的序列、其保守修饰的变体或实质上相同的序列。在一些hiv-1疫苗组合物中，展示的hiv-1env来源的三聚体蛋白来源于gp140。在一些实施方案中，hiv-1env来源的三聚体蛋白是未切割的融合前优化(ufo)gp140三聚体。在这些实施方案中的一些中，ufo gp140三聚体是包含来自hiv-1毒株bg505的经修饰gp41ecto结构域的嵌合三聚体。在一些实施方案中，ufo gp140三聚体的亚基具有seq id no：23中所示的序列、其保守修饰的变体或实质上相同的序列。14.一些特定的hiv-1疫苗组合物包含从n末端到c末端含有以下的亚基序列：如seq id no：23中所示的hiv-1env来源的ufo gp140三聚体亚基、如seq id no：21(e2p)中所示的自组装纳米粒亚基、如seq id no：1(ld4)中所示的锁定结构域，以及t细胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在这些实施方案中的一些中，亚基序列还可以包含在gp140三聚体亚基与纳米粒亚基之间的第一接头序列(ggggs)2(seq id no：24)，和/或在纳米粒亚基与锁定结构域之间的第二接头序列ggggs(seq id no：17)。一些其他特定的hiv-1疫苗组合物包含从n末端到c末端含有以下的亚基序列：如seq id no：23中所示的hiv-1env来源的ufo gp140三聚体、如seq id no：22或25(i3-01)中所示的自组装纳米粒亚基、如seq id no：2(ld7)中所示的锁定结构域，以及t细胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在这些实施方案中的一些中，亚基序列还可以包含在gp140三聚体亚基与纳米粒亚基之间的第一接头序列(ggggs)2(seq id no：24)，和/或在纳米粒亚基与锁定结构域之间的第二接头序列ggggs(seq id no：17)。15.在一个相关方面中，本发明提供了包含本文所述的疫苗组合物的药物组合物。药物组合物通常还包含可药用载体。在一些实施方案中，药物组合物可还包含佐剂。16.在另一方面中，本发明提供了多核苷酸，其编码包含n末端免疫原多肽、自组装纳米粒亚基和锁定结构域亚基的融合蛋白。融合蛋白中的锁定结构域是蛋白质亚基，其可以在溶液中与和附近纳米粒亚基连接的另一锁定结构域通过界面处的非共价相互作用自然形成二聚体。在本发明的一些多核苷酸中，编码的融合蛋白中的锁定结构域是与另一相同蛋白质亚基形成同二聚体的蛋白质亚基。在一些实施方案中，编码的融合蛋白中的免疫原多肽与纳米粒亚基的n末端融合。在一些实施方案中，编码的融合蛋白中的免疫原多肽是多聚体蛋白的亚基。在一些实施方案中，编码的融合蛋白中的锁定结构域位于纳米粒亚基的c末端。在一些实施方案中，编码的融合蛋白还包含在c末端的t细胞表位。在一些实施方案中，编码的融合蛋白中的免疫原多肽是hiv-1env来源的三聚体蛋白的亚基。在这些实施方案中的一些中，编码的融合蛋白可还包含在蛋白质的不同组分之间的一个或更多个接头序列。在这些实施方案中的一些中，编码的融合蛋白可包含在免疫原多肽与纳米粒亚基间的第一接头序列，和/或在纳米粒亚基与锁定结构域之间的第二接头序列。在多个实施方案中，所采用的接头序列可以各自独立地具有(gasb)n的序列，其中a为1至4的整数，b为1至2的整数，并且n为1至6的整数。17.本发明的一些特定的多核苷酸编码本文所述的hiv-1多肽疫苗组合物。在这些实施方案中的一些中，编码的融合蛋白从n末端到c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚体亚基、如seq id no：21(e2p)中所示的自组装纳米粒亚基、如seq id no：1(ld4)中所示的锁定结构域，以及t细胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在一些实施方案中，编码的融合多肽还可以包含在gp140三聚体亚基与纳米粒亚基之间的第一接头序列(ggggs)2(seq id no：24)，和/或在纳米粒亚基与锁定结构域之间的第二接头序列ggggs(seq id no：17)。在一些另外的实施方案中，编码的融合蛋白从n末端到c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚体亚基、如seq id no：22或25(i3-01)中所示的自组装纳米粒亚基、如seq id no：2(ld7)中所示的锁定结构域，以及t细胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在一些实施方案中，编码的融合多肽还可以包含在gp140三聚体亚基与纳米粒亚基之间的第一接头序列(ggggs)2(seq id no：24)，和/或在纳米粒亚基与锁定结构域之间的第二接头序列ggggs(seq id no：17)。18.在一些相关的实施方案中，本发明提供了由本文所述的多核苷酸编码的多肽。在一些相关的实施方案中，本发明提供了具有一种或更多种本文所述的多核苷酸的载体。在另一些相关的实施方案中，本发明提供了包含一种或更多种本文所述的多核苷酸或载体的药物组合物。19.在另一方面中，本发明提供了用于在对象中治疗或预防hiv-1感染的方法。这些方法包括向对象施用包含治疗有效量的本文所述的hiv-1多肽疫苗组合物的药物组合物。在这些实施方案中的一些中，所施用的hiv-1疫苗组合物从n末端至c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚体亚基、如seq id no：21(e2p)中所示的自组装纳米粒亚基、如seq id no：1(ld4)中所示的锁定结构域，以及t细胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在另一些实施方案中，所施用的hiv-1疫苗组合物从n末端到c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚体亚基、如seq id no：22或25(i3-01)中所示的自组装纳米粒亚基、如seq id no：2(ld7)中所示的锁定结构域，以及t细胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在一些相关的实施方案中，本发明提供了通过向对象施用包含治疗有效量的本文所述的多核苷酸或表达载体的药物组合物来在对象中治疗或预防hiv-1感染的方法。在这些实施方案中的一些中，所施用的多核苷酸或载体编码融合蛋白，所述融合蛋白从n末端至c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚体亚基、如seq id no：21(e2p)中所示的自组装纳米粒亚基、如seq id no：1(ld4)中所示的锁定结构域，以及t细胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。在另一些实施方案中，所施用的多核苷酸或载体编码融合蛋白，所述融合蛋白从n末端至c末端包含以下：seq id no：23中所示的ufo gp140三聚体亚基、如seq id no：22或25(i3-01)中所示的自组装纳米粒亚基、如seq id no：2(ld7)中所示的锁定结构域，以及t细胞表位akfvaawtlkaaa(seq id no：18)。20.通过参考说明书的其余部分和权利要求书，可以实现对本发明的本质和优点的进一步理解。附图说明21.图1示出了hiv-1ufo gp140纳米粒疫苗的结构。22.图2示意性示出了表达本文所述的锁定结构域稳定的hiv-1纳米粒免疫原的实例的cmv载体的结构。23.图3示出了通过多种测定对cho/expicho产生的纳米粒蛋白质的品质评估的结果。24.图4示出了两种锁定结构域稳定的hiv-1纳米粒免疫原的抗原和结构分析的体外评估。25.图5示出了在小鼠和兔中两种示例性的锁定结构域稳定的hiv-1纳米粒免疫原的免疫原性活性的体内研究。26.图6示意性地示出了用不同锁定结构域稳定的hiv-1纳米粒免疫原的构建体设计，以及显示了在expicho细胞中瞬时表达的疫苗免疫原的产量和纯度的尺寸排阻色谱法(sec)谱。27.图7示出了用不同锁定结构域稳定的hiv-1纳米粒免疫原的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(bn-page)分析，以及一些良好形成的纳米粒的负染色电子显微术(em)图像。28.图8示出了埃博拉gpδmuc三聚体展示纳米粒的分子模型、尺寸排阻色谱法(sec)和负染色em图像，接着是具有多种锁定结构域的埃博拉gpδmuc三聚体展示纳米粒的设计理念和分子模型、生物化学和生物物理分析(例如sec和蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(bn-page))和抗原表征(例如elisa)。示出了与e2p组合的ld1-ld7以及与i3-01组合的ld4-ld9(其均展示埃博拉gpδmuc-ufog三聚体)的sec谱。29.图9示出了拉沙病毒(lasv)gpc三聚体展示纳米粒的分子模型，以及24聚体铁蛋白纳米粒上和具有锁定结构域ld4和t细胞表位padre的60聚体e2p纳米粒上gpc三聚体的负染色em图像。30.图10示出了人呼吸道合胞病毒(hrsv)f三聚体展示纳米粒的分子模型，以及24聚体铁蛋白纳米粒上、具有锁定结构域ld4和t细胞表位padre的60聚体e2p纳米粒上、和具有锁定结构域ld7和padre的60聚体i3-01纳米粒上hrsvf三聚体的负染色em图像。31.图11示出了mers冠状病毒s三聚体展示纳米粒的分子模型，以及24聚体铁蛋白纳米粒上、具有锁定结构域ld4和t细胞表位padre的60聚体e2p纳米粒上、和具有锁定结构域ld7和padre的60聚体i3-01纳米粒上mers冠状病毒s三聚体矛(pike)的负染色em图像。32.图12示出了具有和不具有锁定结构域的丙型肝炎病毒(hcv)糖蛋白e2核芯展示纳米粒的疫苗理念、分子模型、生物化学和生物物理分析(例如尺寸排阻色谱法(sec)、蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(bn-page)和负染色em图像)以及抗原表征，例如elisa结合。33.图13示出了寨卡病毒(zikv)diii-10gs-i3-01纳米粒的分子模型，接着是24聚体铁蛋白纳米粒上、60聚体e2p纳米粒上、和具有锁定结构域ld7和t细胞表位padre的60聚体i3-01纳米粒上展示的diii结构域的生物化学和生物物理表征，例如尺寸排阻色谱法(sec)、蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(bn-page)和负染色em分析。34.图14示出了恶性疟原虫(p.falciparum(疟疾))抗原pfs25及其与已知中和抗体的复合物的结构，具有颈部结构域的pfs25纳米粒的设计理念，以及24聚体铁蛋白纳米粒上、具有锁定结构域ld4和t细胞表位padre的60聚体e2p纳米粒上、和具有锁定结构域ld7和padre的60聚体i3-01上(其均具有插入在pfs25与纳米粒之间的颈部结构域)pfs25的负染色em图像。35.图15示出了恶性疟原虫(疟疾)抗原环子孢子蛋白(csp)的示意性组成，gsk rts，s疫苗的示意性组成，设计基于csp的纳米粒疫苗的分步策略的流程图，60聚体铁蛋白上和具有锁定结构域ld7和t细胞表位padre的60聚体i3-01纳米粒上抗原csp的多种组分的负染色em图像，以及尺寸排阻色谱法(sec)谱。36.图16示出了前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)的结构，具有颈部结构域的pcsk9纳米粒的设计理念，以及24聚体铁蛋白纳米粒上和具有锁定结构域ld7和t细胞表位padre的60聚体i3-01纳米粒上(其均具有插入在pcsk9与纳米粒之间的颈部结构域)pcsk9的负染色em图像。具体实施方式37.i.概述38.本发明部分地基于本发明人针对多种病毒或非病毒靶标(例如，hiv-1env、埃博拉gp、hcv e2蛋白或结核分枝杆菌(m.tuberculosis)抗原)的新疫苗免疫原以及表现出改善的稳定性和活性的纳米粒展示的免疫原(即疫苗组合物)的开发。通常来说，本发明的疫苗或疫苗组合物包含展示在自组装纳米粒或病毒样颗粒(vlp)上的免疫原多肽或蛋白质(例如，hiv-1env来源的三聚体蛋白)。纳米粒疫苗还包含一种或更多种本文所述的新结构组分。这些另外的结构组分发挥促进免疫原在纳米粒表面上的展示，增强展示的免疫原的稳定性和/或改善自组装蛋白质疫苗的产量和纯度的作用。在一些实施方案中，本发明的纳米粒疫苗包含使纳米粒稳定的锁定结构域。如本文实施例中详述的，锁定结构域从内部使纳米粒稳定，以使得展示免疫原多肽(例如，hiv-1env来源的三聚体蛋白)的纳米粒在制造、疫苗配制和免疫接种过程中可以保持完整。由此构建的新疫苗免疫原具有显著增强的稳定性。另外，锁定机制独立于纳米粒平台。如本文中示例的(例如hiv-1疫苗)，其可以应用于不同的纳米粒，例如60聚体i3-01和e2p纳米粒并且具有几乎相同的结局，如通过sec、bn-page、dsc、负染色em和抗原谱分析指示的。39.除了锁定结构域以外，编码疫苗的构建体可以另外地或替代地包含多种其他结构组分。例如，可以在免疫原多肽序列与纳米粒亚基序列之间添加以下的编码序列：用于使免疫原多肽稳定的蛋白质结构域，例如t4纤维蛋白(fibritin)的三聚化基序(“foldon”)的编码序列，或用于将免疫原多肽从纳米粒表面升高的蛋白质结构域，例如三螺旋束(“颈部结构域”)的编码序列，或用于促进免疫亲和纯化的蛋白质结构域，例如具有已知结合抗体的蛋白质结构域的编码序列。可以将用作化学缀合的活性位点的多肽片段或基序的编码序列在合适的位置插入构建体中。如本文所述，还可以将另外的结构组分(例如cd4+t辅助表位或cd8+t细胞表位)在合适的位置插入构建体中。如本文示例的，一个或更多个接头(接头序列、基序或部分)可用于连接构建体中的多种结构组分。40.如本文中所详述的，本发明的疫苗组合物是由包含本文所述的结构组分的可操作地连接的编码序列的构建体表达并自组装的。在构建体中，免疫原多肽编码序列在其c末端与纳米粒亚基编码序列的n末端直接或间接融合。如本文所述，将编码其他结构组分的序列在合适的位置插入构建体中。例如，当使用锁定结构域时，锁定结构域编码序列可以与纳米粒亚基编码序列的c末端直接或间接融合。41.本文示例的纳米粒疫苗构建体表现出高产量、高纯度和高稳定性，具有在表面上展示的天然样抗原结构、增强的天然样抗原谱，以及在动物中增强的免疫原性。例如，hiv-1纳米粒疫苗在6至8周内在野生型小鼠和兔中引发了2级(tier-2)自体中和抗体应答，而一起的可溶性三聚体不能在小鼠中诱导任何2级中和抗体，并且需要最少2至3个月的时间来进行抗体引发。因此，本发明的改善的hiv-1疫苗免疫原更适合于疫苗生产，并且能在疫苗接种中产生更好的免疫应答。42.除非本文另有说明，否则本发明的疫苗免疫原、编码多核苷酸、表达载体和宿主细胞以及相关的治疗应用都可以根据本文示例的程序或本领域中公知的常规实践方法产生或进行。参见，例如methods in enzymology，volume 289：solid-phase peptide synthesis，j.n.abelson，m.i.simon，g..b.fields(editors)，academic press；1st edition(1997)(isbn-13：978-0121821906)；美国专利no.4,965,343和5,849,954；sambrook et al.，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor press，n.y.，(3rg ed.，2000)；brent et al.，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，inc.(ringbou ed.，2003)；davis et al.，basic methods in molecular biology，elsevier science publishing，inc.，new york，usa(1986)；或methods in enzymology：guide to molecular cloning techniques vol.152，s.l.berger和a.r.kimmerl eds.，academic press inc.，san diego，usa(1987)；current protocols in protein science(cpps)(john e.coligan，et.al.，ed.，john wiley and sons，inc.)，current protocols in cell biology(cpcb)(juan s.bonifacino et.al.ed.，john wiley and sons，inc.)，以及culture of animal cells：a manual of basic technique by r.ian freshney，publisher：wiley-liss；5th edition(2005)，animal cell culture methods(methods in cell biology，vol.57，jennie p.mather和david barnes editors，academic press，1st edition，1998)。以下各节提供了实施本发明的组合物和方法的其他指导。43.ii.定义44.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：academic press dictionary of science and technology，morris(ed.)，academic press(1st ed.，1992)；oxford dictionary of biochemistry and molecular biology，smith et al.(eds.)，oxford university press(revised ed.，2000)；encyclopaedic dictionary of chemistry，kumar(ed.)，anmol publications pvt.ltd.(2002)；dictionary of microbiology and molecular biology，singleton et al.(eds.)，john wiley&sons(3rd ed.，2002)；dictionary of chemistry，hunt(ed.)，routledge(1st ed.，1999)；dictionary of pharmaceutical medicine，nahler(ed.)，springer-verlag telos(1994)；dictionary of organic chemistry，kumar和anandand(eds.)，anmol publications pvt.ltd.(2002)；以及a dictionary of biology(oxford paperback reference)，martin和hine(eds.)，oxford university press(4th ed.，2000)。b c d e f g h p h c p c。其中h代表疏水性残基，c通常代表带电荷的残基，并且p代表极性(并且因此，亲水性)残基。52.hiv-1包膜蛋白(env)最初被合成为大小为845至870个氨基酸的较长的前体蛋白，称为gp160。gp160形成同三聚体，并且在高尔基体中经历糖基化。在体内，gp160糖蛋白被内切蛋白水解加工成成熟的包膜糖蛋白gp120和gp41，其在病毒表面彼此非共价缔合成复合物。gp120表面蛋白包含对人cd4(hiv的主要受体)的高亲和力结合位点，以及与融合共受体(例如趋化因子受体ccr5和cxcr4)相互作用的结构域。gp41蛋白跨过病毒膜，并且在其氨基末端包含对病毒膜与细胞膜的融合重要的氨基酸序列。hiv-1包膜糖蛋白复合物的天然、可融合形式是由三个gp120和三个gp41亚基构成的三聚体结构。受体结合(cd4和共受体)位点位于gp120部分中，而融合肽位于gp41组分中。野生型gp160多肽的示例性序列在genbank中，例如以登录号aab05604和aad12142示出。53.gp140是指hiv包膜蛋白的寡聚形式，其包含全部gp120和整个gp41胞外域。如本文所用，hiv-1gp140三聚体免疫原通常包含gp140结构域和gp140的经修饰或重新设计的胞外域(gp41ecto)。54.gp120是人免疫缺陷病毒(hiv)的包膜蛋白。gp120包含hiv包膜糖蛋白复合物的大多数外部表面暴露结构域，并且gp120与细胞cd4受体和细胞趋化因子受体(例如ccr5)二者结合。成熟的gp120野生型多肽在一级序列中具有约500个氨基酸。gp120被高度n-糖基化，导致约120kd的表观分子量。该多肽由五个保守区(c1-05)和五个高变区(v1-v5)构成。在其三级结构中，gp120糖蛋白由三个主要结构域(外部结构域、内部结构域和桥接片)加上可变环构成。参见，例如，wyatt et al.，nature393，705-711，1998；以及kwong et al.，nature393，649-59，1998。认为内部结构域与gp41包膜糖蛋白相互作用，而外部结构域暴露在组装的包膜糖蛋白三聚体上。55.gp120的可变区1和可变区2(v1/v2结构域)由约50至90个残基构成，其包含hiv-1的最高可变部分中的两个(v1环和v2环)，并且v1/v2结构域的十分之一残基被n-糖基化。56.gp41是前体hiv包膜蛋白的蛋白水解产物。其包含n末端融合肽(fp)、跨膜结构域以及连接融合肽与跨膜结构域的胞外域。gp41保持三聚体构型，并以非共价方式与gp120相互作用。示例性gp41的氨基酸序列在genbank中以登录号cad20975给出。57.bg505 sosip.664gp140是用来自进化枝a毒株bg505的gp140三聚体开发的hiv-1env免疫原。其包含在切割的gp120与gp41ecto之间利用工程化二硫键的共价连接(称为sos)。此外，其具有i559p突变(称为ip)以使gp41融合后的构象不稳定，并且还有膜近端外部区域(mper)在664位残基处的截短以改善溶解性。这种hiv-1免疫原具有出色的抗原谱和对天然刺突(spike)的出色结构模拟。使用sosip三聚体作为分选探针，已经鉴定和表征了新的bnab。sosip设计也已扩展到其他hiv-1毒株，并允许引入其他稳定突变。最近，报道了sosip三聚体在兔和非人灵长类动物中的免疫原性，为人疫苗试验铺平了道路。58.免疫原是能够在哺乳动物(例如被病原体感染或有被病原体感染的风险的哺乳动物)中诱导免疫应答的蛋白质或其部分。免疫原的施用可导致针对目的病原体的保护性免疫和/或主动免疫(proactive immunity)。59.免疫应答是指免疫系统的细胞(例如b细胞、t细胞或单核细胞)对刺激的应答。在一些实施方案中，应答对特定抗原是特异性的(“抗原特异性应答”)。在一些实施方案中，免疫应答是t细胞应答，例如cd4+应答或cd8+应答。在另一些实施方案中，应答是b细胞应答，并导致特异性抗体的产生。60.免疫原性组合物是指包含免疫原性多肽的组合物，所述免疫原性多肽诱导针对表达免疫原性多肽的病毒的可测量ctl应答，或诱导针对免疫原性多肽的可测量b细胞应答(例如抗体的产生)。61.两个或更多个核酸序列或者两个或更多个氨基酸序列之间的序列同一性或相似性以序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以以百分比同一性来衡量；百分比越高，序列越相同。当出于在比较窗口上或指定区域上针对最大对应性比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测测量的，如果两个序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域，或在未指定时在整个序列上，具有60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则该两个序列“实质上相同”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地存在于长度为100至500或者1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。62.当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高度的序列同一性/相似性。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。以下中描述了多种程序和比对算法：smith&waterman，adv.appl.math.2：482，1981；needleman&wunsch，j.mol.biol.48：443，1970；pearson&lipman，proc.natl.acad.sci.usa 85：2444，1988；higgins&sharp，gene，73：237-44，1988；higgins&sharp，cabios 5：151-3，1989；corpet et al.，nuc.acids res.16：10881-90，1988；huang et al.computer appls.in the biosciences 8，155-65，1992；以及pearson et al.，meth.mol.bio.24：307-31，1994。altschul et al.，j.mol.biol.215：403-10，1990，其给出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。63.术语“对象”是指被分类为哺乳动物的任何动物，例如人和非人哺乳动物。非人动物的实例包括狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。除非另有说明，否则术语“患者”或“对象”在本文中可互换使用。优选地，对象是人。64.术语“治疗”或“减轻”包括向对象施用化合物或药剂以阻止或延迟疾病(例如，hiv感染)的症状、并发症或生化指标的开始，减轻症状或者阻止或抑制疾病、病症或障碍的进一步发展。需要治疗的对象包括已经患有疾病或障碍的那些以及处于患疾病的风险中的那些。治疗可以是预防性的(预防或延缓疾病的发作，或者预防其临床或亚临床症状的表现)，或是疾病表现之后症状的治疗性抑制或缓解。65.未切割的融合前优化(ufo)三聚体是指由gp120蛋白和重新设计的gp41ecto结构域形成的hiv-1gp140三聚体蛋白，其导致更稳定的hiv-1gp140三聚体(图1)。重新设计的gp41ecto结构域基于原型hiv-1毒株bg505(以及原型gp140三聚体bg505 sosip.664gp140)，并且相对于野生型bg505 gp41ecto序列包含一个或更多个修饰。这些修饰包括(1)用较短的环序列替换hr1的21个残基n末端(第548至568位残基)以使融合前gp140结构稳定，以及(2)用柔性接头序列(例如ggggs(seq id no：17)基序的串联重复)替代gp120与gp41之间的弗林蛋白酶切割位点(第508至511位残基)。在一些实施方案中，ufo三聚体还可包含在gp120与gp41之间的工程化二硫键和/或gp41中的稳定化突变。例如，基于hiv-1毒株bg505的ufo三聚体可以包含在残基a501c与t605c之间的工程化二硫键。ufo三聚体的详细描述在例如kong et al.，nat.comm.7：12040，2016中提供。除了基于bg505毒株序列的ufo三聚体外，工程化gp41ecto结构域可用于与来自许多不同hiv-1毒株或亚型的gp120多肽配对以形成“嵌合”gp140三聚体。这样的嵌合三聚体被称为“ufo-bg”或“ufo2-bg”，如本文示例的。ufo-bg和ufo2-bg三聚体的详细描述在例如he et al.，sci adv.4(11)：eaau6769，2018中提供。66.疫苗是指在对象中引起预防性或治疗性免疫应答的药物组合物。在一些情况下，免疫应答是保护性免疫应答。通常，疫苗引起针对病原体(例如病毒病原体)的抗原或与病理状况相关的细胞成分的抗原特异性免疫应答。疫苗可包括多核苷酸(例如，编码公开的抗原的核酸)、肽或多肽(例如公开的抗原)、病毒、细胞或者一种或更多种细胞成分。在本发明的一些实施方案中，疫苗或疫苗免疫原或疫苗组合物从融合构建体表达并自组装到在表面上展示免疫原多肽或蛋白质的纳米粒中。67.病毒样颗粒(vlp)是指来源于多种病毒中任一种的非复制性病毒壳。vlp通常由一种或更多种病毒蛋白质构成，例如但不限于被称为衣壳蛋白、外壳蛋白、壳蛋白、表面蛋白和/或包膜蛋白的那些蛋白质或者来源于这些蛋白质的颗粒形成多肽。在适当的表达系统中蛋白质的重组表达之后，vlp可以自发形成。用于产生特定vlp的方法是本领域中已知的。病毒蛋白质重组表达之后vlp的存在可以使用本领域中已知的常规技术(例如通过电子显微术、生物物理表征等)来检测。参见，例如，baker et al.(1991)biophys.j.60：1445-1456；以及hagensee et al.(1994)j.virol.68：4503-4505。例如，vlp可以通过密度梯度离心分离和/或通过特征性密度带鉴定。替代地，可以对所讨论的vlp制剂的玻璃化含水样品进行冷冻电子显微术，并在适当的曝光条件下记录图像。68.自组装纳米粒是指具有数十纳米的直径和良好确定的表面几何学的球形蛋白质壳，其由能够自动组装成具有与vlp类似外观的纳米粒的非病毒蛋白的相同拷贝形成。已知实例包括铁蛋白(fr)，其在物种间保守并且形成24聚体，以及嗜热脂肪芽孢杆菌二氢硫辛酰基酰基转移酶(e2p)、风产液菌(aquifex aeolicus)二氧四氢喋啶合酶(lumazine synthase，ls)和海栖热袍菌(thermotoga maritima)encapsulin，其均形成60聚体。在适当的表达系统中蛋白质重组表达之后，自组装纳米粒可以自发形成。可以使用为vlp开发的相同技术进行纳米粒的产生、检测和表征方法。69.iii.用于产生疫苗组合物的免疫原多肽或蛋白质70.任何多肽免疫原或多聚体蛋白质均可用于本发明的疫苗设计。这些包括来自可期望针对其引起免疫应答的病原体的任何蛋白质或多肽。因此，本发明的疫苗组合物可以利用来源于任何病毒、细菌或其他病原性生物体的免疫原多肽。用于本发明的合适的免疫原多肽也可以来源于非病原性物种，包括人蛋白质，针对其引起的免疫应答可具有治疗作用，减轻疾病症状或改善总体健康。通常，免疫原多肽可以是包含至少约10个氨基酸残基的任何结构或功能多肽或肽。在一些实施方案中，免疫原多肽的长度为约10至约10,000个氨基酸残基。在一些实施方案中，免疫原多肽的长度为约25至约2,000个氨基酸残基。在一些实施方案中，免疫原多肽的长度为约50至约500个氨基酸残基。因此，适用于本发明的免疫原多肽或蛋白质的分子量可以为约1kda至约1,000kda，并且优选约2.5kda至约250kda。在一些更优选的实施方案中，所采用的免疫原多肽的分子量为约5kda至约25kda或50 kda。71.在一些实施方案中，用于本发明疫苗组合物中的免疫原多肽或蛋白质可以来源于病毒表面或核芯蛋白(靶多肽)。有许多对于宿主细胞的病毒感染重要的已知病毒蛋白。实例包括但不限于hiv的糖蛋白(或表面抗原，例如gp120和gp41)和衣壳蛋白(或结构蛋白，例如p24蛋白)；甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒的表面抗原或核芯蛋白(例如小乙型肝炎病毒表面抗原(s-hbsag)和丙型肝炎病毒的核芯蛋白ns3、ns4和ns5抗原)；eb病毒(ebv)的糖蛋白gp350/220，呼吸道合胞病毒(rsv)的糖蛋白(g蛋白)或融合蛋白(f蛋白)；单纯疱疹病毒hsv-1和hsv-2的表面和核芯蛋白(例如，来自hsv-2的糖蛋白d)，脊髓灰质炎病毒的表面蛋白(例如，gb、gc、gd、gh和gl)，麻疹病毒(mv)的包膜糖蛋白血凝素(h)和融合蛋白(f)，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)的糖蛋白g，腺病毒的纤维和五邻体基底蛋白(penton base protein)，冠状病毒的s刺突蛋白，黄病毒(例如登革热病毒、黄热病病毒和寨卡病毒)的包膜(e)蛋白，以及小核糖核酸病毒的无包膜衣壳蛋白。72.在一些实施方案中，适用于本发明的病毒免疫原可来源于利用i类融合机制进行感染的病毒。i类病毒融合蛋白是三聚体，其在细胞进入过程中会经历剧烈的构象变化。病毒蛋白中的特定区域可以完全重折叠以促进膜融合。如本文中示例的，利用i类融合机制的病毒的免疫原的实例包括获自以下的结构蛋白或多肽：hiv-1、引起出血热的病毒例如丝状病毒(例如埃博拉病毒和马尔堡病毒)和沙粒病毒(例如拉沙病毒)、呼吸道合胞病毒(rsv)、以及冠状病毒如mers-cov和sars-cov。如本文示例的，合适的免疫原可以是来源于hiv-1ufo三聚体、埃博拉gp胞外域、lasv糖蛋白复合物(gpc)、rsv糖蛋白f和mers-cov刺突蛋白s的任何蛋白质和多肽。这些免疫原或者来源于利用i类融合机制的其他病毒的结构蛋白的免疫原中的任一种均可用于本发明的疫苗设计。73.在一些实施方案中，适用于本发明的病毒免疫原可以来源于利用ii类融合机制进行感染的病毒。ii类病毒融合蛋白以异二聚体(例如丙型肝炎病毒)或同二聚体(例如登革热和寨卡病毒)的形式存在，其将在膜融合之前重新折叠以形成三聚体刺突。如本文示例的，合适的免疫原可以是来源于hcv包膜糖蛋白(例如，e2)、寨卡病毒e蛋白(例如，diii结构域)或利用ii类融合机制的其他病毒的任何结构蛋白的任何蛋白质和多肽。这些免疫原中的任一种都可以容易地用于本发明的疫苗设计中。74.在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物中使用的免疫原多肽或蛋白质可以来源于非病毒靶标。这些包括可以从任何非病毒病原体(例如细菌病原体)以及哺乳动物宿主(例如人)体内的寄生生物体获得的免疫原。在一些实施方案中，对于细菌感染重要的细菌蛋白质适合于获得本发明的疫苗设计中的免疫原多肽。合适的免疫原可以是来源于细菌的结构蛋白的任何蛋白质和多肽，例如本文以结核分枝杆菌(tb)为例的ag85复合物和mtb72。在一些实施方案中，对于寄生虫传播、在宿主中繁殖和生命周期重要的寄生蛋白质适合于获得本发明的疫苗设计中的免疫原多肽。合适的免疫原可以是来源于寄生生物的结构蛋白的任何蛋白质和多肽，例如如本文示例的恶性疟原虫(疟疾)的pfs25、环子孢子蛋白(csp)和网织红细胞结合蛋白同源物5(pfrh5)。75.在一些实施方案中，所采用的免疫原多肽可以是来自期望针对其引起免疫应答的哺乳动物宿主(例如人)的内源蛋白。这些包括例如如本文示例的用于调节胆固醇水平的pcsk9，以及用于控制食欲的食欲刺激素(ghrelin)。多种其他哺乳动物蛋白也可用于获得合适的免疫原多肽，以用于构建根据本发明的设计的疫苗。在一些实施方案中，用于疫苗设计的非病毒靶标可以是参与人疾病的其他蛋白质。这些包括参与癌症发生的蛋白质。癌症相关免疫原的实例还包括非突变的自身抗原，例如，mage-a3、melan-a/martl、gp100、her2/neu和ny-eso-1。在另一些实施方案中，用于本发明疫苗组合物的免疫原多肽或蛋白质包括参与其他慢性人疾病或病症的蛋白质。这样的人靶标的实例包括，例如针对高血压的ang-ii、针对炎症的tnf-α、针对病原体诱导的嗜酸性粒细胞增多的il-9、针对哮喘的il-5、针对中风的n-甲基-d-天冬氨酸受体-1，以及针对降低的激素水平的人绒毛膜促性腺激素(hcg)。76.iv.锁定结构域77.如上所述，本发明的一些纳米粒疫苗或免疫原利用发明人开发的锁定机制。锁定机制是指用于在展示免疫原蛋白或多肽(例如，env来源的hiv-1三聚体蛋白)时从内部使纳米粒稳定的蛋白质结构域(“锁定结构域”)。通常，锁定结构域可以是能够形成二聚体的任何蛋白质。在多种实施方案中，锁定结构域是蛋白亚基，其可以与溶液中的另一蛋白质亚基通过界面处的非共价相互作用自然形成二聚体。在一些优选的实施方案中，两个蛋白质亚基可以在序列上相同并且形成同二聚体。在另一些情况下，两个蛋白质亚基可以是不同的蛋白质或通过工程化得到的单个蛋白质的两个不同结构域，其可以通过界面处的非共价相互作用在溶液中形成异二聚体。通常，锁定结构域与免疫原多肽(例如，hiv-1env来源的三聚体蛋白的亚基)连接的纳米粒亚基共价融合。在一些优选的实施方案中，锁定结构域选自具有不超过约500个氨基酸的二聚体蛋白，以使得其可以被包封在纳米粒壳内。在一些实施方案中，锁定结构域来源于具有不超过约400、300、250、200、150个或更少氨基酸的二聚体蛋白。在一些实施方案中，锁定结构域来源于包含约30至约100个氨基酸的二聚体蛋白。如本文所述，锁定结构域可以是能够通过特定相互作用(例如疏水性(范德华力)接触、氢键和/或盐桥)形成界面的任何二聚体蛋白。在一些实施方案中，锁定结构域可以是能够通过螺旋、片层、环或上述结构元件的任何组合的相互作用形成界面的任何二聚体蛋白。在一些实施方案中，锁定结构域可以是能够形成界面的任何二聚体蛋白，在该界面处可以改造共价键，例如二硫键或特定的化学连接。在多种实施方案中，二聚体的两个亚基之间的亲和力足够强以抵抗外部干扰，例如热和化学加工，在其他情况下缺少这种锁定结构域的野生型(wt)纳米粒将不能耐受该外部干扰。78.在本发明的实践中，本领域中已知的许多蛋白质可以用作锁定结构域。这些包括例如本文在以下实施例中示例的两个锁定结构域ld4(seq id no：1)和ld7(seq id no：2)。seq id no：3至16中示出了适用于本发明的一些其他示例性锁定结构域。如本文针对hiv-1疫苗示例的，通过锁定结构域ld4或ld7稳定的hiv-1纳米粒ufo三聚体疫苗表现出出乎意料的强免疫原性特性。除了具有这些示例性序列中的任一个的锁定结构域之外，还可以使用保守修饰的变体或具有实质上相同的序列的变体。79.合适的锁定结构域可以容易地从来自蛋白质数据库(pdb)的已知蛋白质中鉴定。例如，可以使用关键词例如“同二聚体”或搜索标准例如“蛋白质化学计量a2(protein stoichiometry a2)”从蛋白质数据库(pdb)(https：//www.rcsb.org/)或其他数据库中找到二聚体蛋白。这些二聚体蛋白可根据其大小(特别是30至100个氨基酸)进一步过滤。可以目测检查剩余的蛋白质，以鉴定具有紧凑结构折叠或其他期望特性的蛋白质。如本文中示例的，使用这些程序，鉴定了若干二聚体蛋白，并且根据需要如下所详述的进行了修饰。在由此鉴定的约20种二聚体蛋白中，9种被测试为锁定结构域以使60聚体纳米粒e2p和i3-01稳定。下面列出了9种测试的锁定结构域的序列。与其原始序列相比，出于工程化目的，实际使用的锁定结构域的序列(seq id no：1至9)可以在柔性n和/或c末端中包含一些残基的截短。就经工程化的ld9(seq id no：9)而言，除了在原始序列的n和c末端截短外，其还在第42位残基处包含s->a突变。80.ld1 1ni8_a：[0081][0082]ld2 4aya_b：[0083][0084]ld31ovx_a：[0085][0086]ld4 2mg4_a：[0087][0088]ld5 2jv7_a：[0089][0090]ld6 1jr5_a：[0091][0092]ld7 1pzq_a：[0093][0094]ld8 1r2a_a：[0095][0096]ld9 2jrx_a：[0097][0098]除了这些测试的ld之外，具有相似结构特征的其他二聚体蛋白也可用于使纳米粒表面稳定。这样的其他序列的实例包括：[0099]1l6e_a：[0100][0101]1pzr_a：[0102][0103]1r05_a：[0104][0105]1tkv_a：[0106][0107]2dsm_a：[0108][0109]2jpq_a：[0110][0111]2k01_a：[0112][0113]除了这些特定的ld和二聚体蛋白之外，与上述标准匹配的其他蛋白质(其已经存在或可以容易地从蛋白质数据库(pdb)获得)也可以用作本发明的锁定结构域。此外，如果符合上述结构和功能要求，大二聚体蛋白的界面形成部分或结构域可以用作独立的锁定结构域。[0114]v.其他结构组分或基序[0115]除了锁定结构域外，本发明的纳米粒展示的免疫原疫苗构建体和所得疫苗组合物可以另外地或替代地包含其他结构组分或基序。在一些实施方案中，本发明的锁定结构域稳定的纳米粒疫苗还包含t细胞表位，以促进稳健的t细胞应答并引导b细胞向bnab发展。t细胞表位可以位于相对于其他结构组分的任何位置，只要其不影响免疫原多肽在纳米粒表面上的展示即可。因此，在一些实施方案中，t细胞表位位于纳米粒亚基的c末端，例如通过t细胞表位的n末端与纳米粒亚基的c末端融合。在另一些实施方案中，t细胞表位位于免疫原多肽的c末端与纳米粒亚基的n末端之间。本领域中已知的任何t细胞表位序列或肽均可用在本发明的实践中。其包括任何包含mhc ii类表位并且在免疫后可以有效活化cd4+和cd8+t细胞的多肽序列，例如活化cd4+t辅助细胞的t-辅助表位。参见，例如alexander et al.，immunity 1，751-761，1994；ahlers et al.，j.clin.invest.108：1677-1685，2001；fraser et al.，vaccine 32，2896-2903，2014；de groot et al.，immunol.cell biol.8：255-269，2002；以及gene ther.21：225-232，2014。在一些优选的实施方案中，采用的t辅助表位是通用的泛反应性t细胞表位肽akfvaawtlkaaa(seq id no：18)(alexander et al.，immunity 1，751-761，1994)。合适的t细胞表位的其他实例包括肽qsialsslmvaqaip(seq id no：19)和ilmqyikanskfigipmglpqsialsslmvaq(seq id no：20)，或这些示例性t细胞表位肽中任一个的保守修饰的变体或实质上相同(例如，至少90％、95％或99％相同)的序列。[0116]作为本文所述的锁定结构域和其他结构组分的替代或补充，本发明的一些纳米粒疫苗包含颈部区域或结构域，以促进免疫原在纳米粒表面上的展示。如本文用pcsk9疫苗和用于疟疾疫苗的恶性疟原虫免疫原pfs25示例的，颈部区域构成了来源于病毒蛋白的三螺旋束。通常，颈部结构域插入在免疫原与纳米粒亚基之间，从而使免疫原多肽从纳米粒表面升高。任选地，接头序列(例如10gs接头)可用于颈部结构域的插入。用于颈部结构域的合适蛋白质的实例包括来源于本文示例的亨德拉病毒结构域(pdb id：4heo)和麻疹病毒结构域(pdb id：1oks)的螺旋束。如所证明的，这样的结构设计可以进一步改善所得纳米粒疫苗的产量和纯度。[0117]作为本文所述的锁定结构域和其他结构组分的替代或补充，本发明的一些纳米粒疫苗可包含用于使免疫原多肽稳定的蛋白质结构域。在一些实施方案中，实现该目的所采用的蛋白质结构域可以是本领域中公知的t4纤维蛋白的c末端三聚化基序(foldon)。该foldon结构域构成来自噬菌体t4的三聚体蛋白纤维蛋白的c末端30个氨基酸残基，并用于促进纤维蛋白的折叠和三聚化。参见，例如，papanikolopoulou et al.，j.biol.chem.279：8991-8998，2004；以及guthe et al.，j.mol.biol.337：905-915，2004。如本文用用于mers-cov疫苗的s刺突蛋白三聚体示例的，该蛋白质结构域可以容易地插入在s刺突蛋白亚基与纳米粒亚基之间。任选的接头(例如10gs接头)可用于插入。与插入在纳米粒亚基的c末端的锁定结构域不同，该蛋白质结构域(foldon)插入在纳米粒亚基的n末端。如本文用mers-cov疫苗所证明的，这种结构组分(例如foldon)在单独使用或与锁定结构域组合使用时可以增强在纳米粒表面上展示的免疫原的稳定性。[0118]在多种实施方案中，展示本文所述的任何免疫原多肽或蛋白质(例如，hiv-1env来源的三聚体免疫原)的纳米粒可通过将免疫原多肽或多聚体免疫原蛋白(例如三聚体免疫原)的亚基与纳米粒的亚基(例如e2p或i3-01亚基)和锁定结构域以及本文所述的其他任选或替代组分融合来构建。为了构建本发明的展示融合疫苗免疫原的纳米粒，可以采用一个或更多个接头基序或部分来促进连接不同组分并维持不同组分的结构完整性。因此，在一些实施方案中，接头基序可用于将免疫原多肽(例如，hiv-1三聚体蛋白亚基)的c末端与纳米粒亚基的n末端连接。另外地或可替代地，第二接头基序可用于将纳米粒亚基的c末端(或免疫原多肽的c末端)与锁定结构域的n末端连接。在另一些实施方案中，第三接头基序可用于连接t细胞表位，例如，将锁定结构域的c末端和t细胞表位的n末端连接，或将t细胞表位的c末端与锁定结构域的n末端连接。如本文示例的，接头也可用于将颈部结构域或foldon结构域插入纳米粒疫苗构建体中。通常来说，接头基序包含短肽序列。在多种实施方案中，接头或接头基序可以是连接两个蛋白质结构域而不干扰其功能的任何柔性肽。例如，在构建体中使用的这些接头中的任一个可以是具有(gasb)n序列的富含gc的肽，其中a是约1至5的整数，b是约0至2的整数，并且n是约1至5的整数。在另一些实施方案中，t细胞表位可以用作免疫原多肽的c末端与纳米粒亚基的n末端之间的接头或接头的一部分。[0119]本发明的具有本文所述的新结构组分(例如，用锁定结构域稳定的hiv-1三聚体免疫原)的疫苗组合物可以根据本文所述的方案(例如，实施例1至15)和/或本领域中(例如he et al.，nat.comm.7，12041，2016；kong et al.，nat.comm.7，12040，2016；以及he et al.，sci adv.4(11)：eaau6769，2018)描述的其他方法重组构建。作为示例，本文描述了两种特定的hiv-1纳米粒疫苗构建体。第一种构建体表达从n末端到c末端包含以下的融合多肽：hiv-1ufo bg505.sosip.664gp140亚基、e2p亚基(例如seq id no：21)、上述接头基序(gasb)n(例如(ggggs)2(seq id no：24))、如seq id no：1(ld4)中所示的锁定结构域，以及t细胞表位(例如seq id no：18中所示的padre表位)。任选地，免疫原多肽(例如，用于hiv-1疫苗的gp140亚基)可以通过接头序列例如ggggs(seq id no：17)或(ggggs)2(例如，seq id no：24)与纳米粒亚基(例如，e2p)连接。第二种构建体表达从n末端到c末端包含以下的融合多肽：hiv-1ufo bg505.sosip.664gp140、接头序列(ggggs)2(seq id no：24)、i3-01亚基(例如、seq id no：22或25)、上述第二接头(gasb)n(例如ggggs(seq id no：17))、如seq id no：2(ld7)中所示的锁定结构域，以及t细胞表位(例如，如seq id no：18所示的表位)。任选地，在本发明的任何疫苗构建体中，可以将二肽接头gs插入锁定结构域与t细胞表位之间。疫苗免疫原(例如，hiv-1纳米粒免疫原)的抗原性和结构完整性可通过标准测定(例如抗体结合测定和负染色电子显微术(em))容易地分析。如本文示例的，融合分子可以全部自组装成展示env来源的三聚体(例如gp140)的免疫原性表位的纳米粒。通过引起稳健的三聚体特异性bnab，本发明的纳米粒疫苗可用于针对本文所示例的多种病毒(例如，hiv-1、埃博拉、拉沙和hcv病毒)对个体进行疫苗接种。[0120]vi.呈递支架(presenting scaffold)[0121]在本发明疫苗的构建中，任何异源支架都可用于呈递免疫原蛋白或多肽(例如，hiv-1env三聚体蛋白)。这包括病毒样颗粒(vlp)，例如噬菌体qβ vlp和纳米粒。在一些优选的实施方案中，用于呈递或展示三聚体hiv-1蛋白的异源支架是自组装纳米粒。多种纳米粒平台可用于产生本发明的疫苗组合物。通常来说，用于本发明的纳米粒需要由单个亚基的多个拷贝形成。纳米粒通常是球形的，和/或具有旋转对称性(例如，具有3次对称和5次对称轴)，例如具有本文示例的二十面体结构。另外地或替代地，颗粒亚基的氨基末端必须暴露于并紧邻3次对称轴，并且三个氨基末端的间隔必须紧密匹配多种hiv-1三聚体组分的羧基末端的间隔。在一些优选的实施方案中，免疫原包含具有约20nm或更小的直径和在颗粒表面上的3次对称轴的自组装纳米粒(通常由12个、24个或60个亚基组装)。这样的纳米粒提供了合适的颗粒平台以产生多价疫苗，例如如本文示例的hiv-1三聚体疫苗。[0122]在一些优选的实施方案中，免疫原蛋白或多肽(例如，hiv-1三聚体蛋白)呈递在自组装纳米粒上，例如来源于本文示例的铁蛋白(fr)、e2p和i3-01的自组装纳米粒。e2p是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的二氢硫辛酰基酰基转移酶的重新设计变体，已显示其自组装成热稳定的60聚体纳米粒。参见，例如，he et al.，nat.commun.7：12041，2016。类似地，i3-01是可自组装成超稳定的纳米粒的工程化蛋白。参见，例如，hsia et al.，nature535，136-139，2016。这些蛋白质的亚基的序列是本领域中已知的。参见，例如，wo2017/192434。如本文示例的e2p和i3-01纳米粒亚基的氨基酸序列分别显示在seq id no：21和22中。相对于原始序列，seq id no：21中所示的e2p序列在第92位残基处包含ala替换，如以下序列中突出显示的。除了seq id no：22中所示的i3-01亚基序列外，seq id no：25中所示的重新设计的i3-01亚基序列也可用于本发明的实践中。在多种实施方案中，本发明的hiv-1纳米粒疫苗可以使用任何这些已知的纳米粒，以及它们的保守修饰的变体或具有实质上相同(例如，至少90％、95％或99％相同)的序列的变体。[0123]e2p亚基序列(seq id no：21)[0124][0125]i3-01亚基序列(seq id no：22)[0126][0127]i3-01-jz9变体序列(seq id no：25)[0128][0129]铁蛋白序列(seq id no：26)[0130][0131]除了这些示例性的纳米粒序列外，本领域中已知的许多其他纳米粒或vlp也可用于本发明的实践中。这些包括，例如，风产液菌二氧四氢喋啶合酶、海栖热袍菌encapsulin、黄色黏球菌(myxococcus xanthus)encapsulin、噬菌体qβ病毒颗粒、兽棚病毒(flock house virus，fhv)颗粒、orsay病毒颗粒和传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，ibdv)颗粒。[0132]如上所述，许多疫苗免疫原可用于本发明的疫苗设计中。这些包括多种病毒免疫原和非病毒蛋白。在hiv-1疫苗的情况下，任何env来源的hiv-1三聚体蛋白均可用于纳米粒呈递疫苗组合物中。可以从多种hiv-1毒株获得env来源的三聚体蛋白。在一些实施方案中，纳米粒呈递基于hiv-1env的糖蛋白或结构域(例如gp140、gp120或v1v2结构域)的天然三聚体形式。在一些实施方案中，所采用的hiv-1env来源的三聚体蛋白是未切割的融合前优化(ufo)gp140三聚体。在一些实施方案中，env来源的三聚体来自hiv-1毒株bg505，例如bg505.sosip.664gp140三聚体。在一些实施方案中，纳米粒呈递经修饰的gp140三聚体免疫原，例如kong et al.，nat.comm.7，12040，2016中描述的hr1修饰的gp140三聚体(“ufo三聚体”)。该hr1修饰的gp140三聚体蛋白的亚基的氨基酸序列显示在seq id no：23中。在一些实施方案中，用于本发明的hiv-1三聚体免疫原可以是ufo2-bg三聚体。ufo2-bg三聚体是嵌合gp140三聚体，其包含(1)具有重新设计的hr1 n末端弯曲和切割位点接头的bg505gp41结构域(如kong et al.，nat.comm.7，12040，2016中所述)和(2)来自其他多种hiv-1毒株或亚型之一的gp120蛋白。除了来自bg505毒株的重新设计的gp41ecto结构域外，适合于本发明的嵌合gp140三聚体中的gp41结构域也可以是来源于hiv-1序列数据库的共有gp41ecto结构域。也可用于构建本发明的hiv-1纳米粒疫苗的是本文所述的多种hiv-1三聚体蛋白的保守修饰的变体，或其具有实质上相同的序列的变体。[0133]hr1修饰的gp140三聚体的序列(seq id no：23)[0134][0135]vii.多核苷酸和表达构建体[0136]本发明的疫苗组合物通常是通过首先产生表达构建体(即表达载体)产生的，所述表达构建体包含可操作连接的本文所述的多种结构组分的编码序列。因此，在一些有关方面中，本发明提供了基本上纯化的多核苷酸(dna或rna)，其编码具有本文所述的新结构组分的纳米粒展示的免疫原(例如，用锁定结构域稳定的hiv-1env三聚体展示纳米粒)，以及具有这样的多核苷酸的表达载体(例如本文示例的cmv载体)和用于产生疫苗免疫原的宿主细胞(例如本文示例的expicho细胞)。由多核苷酸编码或由载体表达的融合多肽也包括在本发明中。如本文所述，这样的多肽将自组装成在其表面上展示免疫原多肽或蛋白质的纳米粒疫苗。[0137]多核苷酸和相关载体可以通过标准分子生物学技术或本文示例的方案容易地产生。例如，用于克隆、转染、瞬时基因表达和获得稳定转染的细胞系的一般方案在本领域中描述，例如，sambrook et al.，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor press，n.y.，(3rd ed.，2000)；以及brent et al.，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，inc.(ringbou ed.，2003)。可以如以下中所述进行通过pcr将突变引入多核苷酸序列，例如pcr technology：principles and applications for dna amplification，h.a.erlich(ed.)，freeman press，ny，ny，1992；pcr protocols：a guide to methods and applications，innis et al.(ed.)，academic press，san diego，ca，1990；mattila et al.，nucleic acids res.19：967，1991；以及eckert et al.，pcr methods and applications 1：17，1991。[0138]特定载体的选择取决于融合多肽的预期用途。例如，选择的载体必须能够驱动期望细胞类型中融合多肽的表达，无论该细胞类型是原核还是真核的。许多载体包含允许可操作地连接的基因序列的真核表达和原核载体复制二者的序列。可用于本发明的载体可以自主复制，即，该载体在染色体外存在，并且其复制不一定与宿主细胞基因组的复制直接联系。替代地，载体的复制可以与宿主染色体dna的复制联系，例如，载体可以整合到宿主细胞的染色体中，如通过逆转录病毒载体和在稳定转染的细胞系中所实现的。基于病毒的表达载体和基于非病毒的表达载体二者均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生免疫原。非病毒载体和系统包括质粒、附加体载体(通常具有用于表达蛋白质或rna的表达盒)和人人工染色体(参见，例如，harrington et al.，nat.genet.15：345，1997)。可用的病毒载体包括基于慢病毒或其他逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒的载体，基于sv40的载体、乳头瘤病毒、hbp eb病毒、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(sfv)。参见，brent et al.，同上；smith，annu.rev.microbiol.49：807，1995；以及rosenfeld et al.，cell 68：143，1992。[0139]取决于用于表达融合多肽的特定载体，多种已知细胞或细胞系可用于本发明的实践。宿主细胞可以是可以引入携带本发明融合体的重组载体的任何细胞，并且其中允许驱动融合多肽表达的载体可用于本发明。其可以是原核的，例如许多细菌菌株中的任一种，或者可以是真核的，例如酵母或其他真菌细胞、昆虫或两栖动物细胞，或哺乳动物细胞，包括例如啮齿动物、猿猴或人细胞。表达本发明融合多肽的细胞可以是原代培养细胞或可以是已建立的细胞系。因此，除了本文示例的细胞系(例如cho细胞)外，本领域中公知的许多其他宿主细胞系也可用于本发明的实践。这些包括例如多种cos细胞系、hela细胞、hek293、att20、bv2和n18细胞、骨髓瘤细胞系、转化的b细胞和杂交瘤。[0140]使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽在例如winnacker，from genes to clones，vch publishers，n.y.，n.y.，1987中进行了一般讨论。可以通过本领域技术人员已知的许多合适方法中的任一种将融合多肽表达载体引入选择的宿主细胞。为了将融合多肽编码载体引入哺乳动物细胞，所使用的方法将取决于载体的形式。对于质粒载体，可以通过许多转染方法中的任一种引入编码融合多肽序列的dna，所述方法包括例如脂质介导的转染(“脂质转染(1ipofection)”)、deae-葡聚糖介导的转染、电穿孔或磷酸钙沉淀。这些方法例如在上文的brent et al中有详细描述。适合于瞬时转染广泛多种转化的和未转化的或原代细胞的脂质转染试剂和方法是广泛可获得的，使得脂质转染成为将构建体引入真核尤其是培养的哺乳动物细胞的有吸引力的方法。例如，lipofectaminetm(life technologies)或lipotaxitm(stratagene)试剂盒是可获得的。提供用于脂质转染的试剂和方法的其他公司包括bio-rad laboratories、clontech、glen research、life technologies、jbl scientific、mbi fermentas、panvera、promega、quantum biotechnologies、sigma-aldrich和wako chemicals usa。[0141]为了长期高产量地生产重组融合多肽，优选稳定表达。代替使用包含病毒复制起点的表达载体，可以用由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的融合多肽编码序列和选择标志物转化宿主细胞。重组载体中的选择标志物赋予对选择的抗性，并允许细胞将载体稳定整合到其染色体中。常用的选择标志物包括neo，其赋予对氨基糖苷g-418的抗性(colberre-garapin，et al.，j.mol.biol.，150：1，1981)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(santerre et al.，gene，30：147，1984)。通过适当的选择，转染的细胞可以包含融合多肽编码序列的整合拷贝。[0142]viii.药物组合物和治疗应用[0143]在另一方面中，本发明提供了使用具有本文所述的新结构组分(例如，锁定结构域)的纳米粒疫苗组合物的药物组合物和相关的治疗方法。在一些实施方案中，hiv-1env三聚体疫苗组合物可用于预防和治疗hiv-1感染。在多种其他实施方案中，本文所述的包含不同病毒或非病毒免疫原的纳米粒疫苗可用于预防或治疗相应疾病，例如由多种病原体引起的感染。本发明的一些实施方案涉及ebov疫苗用于预防或治疗埃博拉病毒感染的用途。本发明的一些实施方案涉及lasv疫苗用于预防或治疗拉沙病毒感染的用途。本发明的一些其他实施方案涉及使用本文所述的rsv疫苗用于预防或治疗rsv感染。本发明的一些其他实施方案涉及使用本文所述的hcv疫苗用于预防或治疗hcv感染。本发明的另一些其他实施方案涉及使用本文所述的cov疫苗用于预防或治疗mers-cov感染。在一些其他实施方案中，本发明提供了使用zikv疫苗用于预防或治疗寨卡病毒感染的方法。在一些其他实施方案中，本发明提供了使用恶性疟原虫免疫原(例如，pfs25)来源的疫苗用于预防或治疗疟疾的方法。在一些其他实施方案中，本发明提供了使用来源于结核分枝杆菌免疫原ag85a或mtb72的疫苗用于预防或治疗结核病的方法。在另一些其他实施方案中，本发明提供了使用pcsk9疫苗来降低人对象中的ldl胆固醇的方法。[0144]在本发明的多种治疗方法的实践中，向需要预防或治疗疾病或病症(例如，hiv-1感染或疟疾)的对象施用本文所述的相应纳米粒疫苗、免疫原多肽或编码多核苷酸。通常，本文公开的纳米粒疫苗、免疫原多肽或编码多核苷酸包含在药物组合物中。药物组合物可以是治疗制剂或预防制剂。通常，该组合物还包含一种或更多种可药用载剂，以及任选地其他治疗成分(例如，抗生素或抗病毒药物)。组合物中也可以使用多种可药用添加剂。[0145]因此，本发明的一些药物组合物是疫苗组合物。对于疫苗组合物，还可以包含合适的佐剂。合适的佐剂的实例包括例如氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、mpltm和il-12。在一些实施方案中，本文公开的疫苗组合物或纳米粒免疫原(例如，hiv-1疫苗或疟疾疫苗组合物)可以被配制为控释或延时释放制剂。这可以在包含缓释聚合物的组合物中或通过微囊化递送系统或生物黏附凝胶来实现。可以根据本领域公知的标准程序来制备多种药物组合物。参见，例如，remington’s pharmaceutical sciences，19th ed.，mack publishing company，easton，pa.，1995；sustained and controlled release drug delivery systems，j.r.robinson，ed.，marcel dekker，inc.，new york，1978)；美国专利no.4,652,441和4,917,893；美国专利no.4,677,191和4,728,721；以及美国专利no.4,675,189。[0146]本发明的药物组合物可以容易地用于多种治疗或预防应用中，例如用于在对象中治疗hiv-1感染或疟疾，或者引起针对hiv-1或恶性疟原虫的免疫应答。在多种实施方案中，疫苗组合物可用于治疗或预防由纳米粒疫苗中展示的免疫原多肽所来源的病原体引起的感染。因此，本发明的疫苗组合物可用于多种临床环境中，以治疗或预防由多种病毒(例如，hiv-1、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、rsv、mers-cov、sars-cov、hcv、登革热病毒或寨卡病毒)或其他病原体(例如细菌如结核分枝杆菌，和寄生生物例如恶性疟原虫)引起的感染。其还可用于在哺乳动物对象(例如人)中诱导针对内源靶标的期望免疫应答，例如引起针对pcsk9或食欲刺激素的抗体应答。除非另有说明，否则本文提供的用于示例hiv-1疫苗组合物的治疗应用的公开内容可以类似地应用于展示任何其他病毒或非病毒免疫原的纳米粒疫苗。[0147]作为示例，可以将hiv-1纳米粒疫苗组合物施用于对象以诱导针对hiv-1的免疫应答，例如，诱导针对hiv-1的广泛中和的抗体的产生。对于处于发生hiv感染的风险中的对象，可以施用本发明的疫苗组合物以提供针对病毒感染的预防性保护。可以类似地进行来源于本文所述的其他免疫原的疫苗的治疗性和预防性应用。取决于具体的对象和病症，本发明的药物组合物可以通过本领域普通技术人员已知的多种施用方式施用于对象，例如，肌内、皮下、静脉内、动脉内、关节内、腹膜内或肠胃外途径。通常，将药物组合物在足以预防、抑制和/或改善所选疾病或病症或者其一种或更多种症状的条件下施用于需要这样的治疗的对象持续一定时间。以足以诱导针对hiv-1的免疫应答的量施用免疫原性组合物。对于治疗应用，组合物应包含治疗有效量的本文所述的hiv-1纳米粒免疫原。对于预防应用，组合物应包含预防有效量的本文所述的hiv-1纳米粒免疫原。可以基于待治疗或预防的特定疾病或病症、严重程度、对象的年龄以及特定对象的其他个人属性(例如，对象健康的总体状态和对象免疫系统的稳健性)来确定免疫原的合适的量。有效剂量的确定还由动物模型研究随后进行人临床试验指导，并由显著降低对象中所靶向的疾病症状或病症的发生或严重程度的施用方案指导。[0148]对于预防应用，在任何症状之前(例如在感染之前)提供免疫原性组合物。免疫原性组合物的预防性施用用于预防或改善任何随后的感染。因此，在一些实施方案中，待治疗的对象是具有感染(例如，hiv感染)或处于发生感染(例如，hiv感染)的风险中的对象，例如由于暴露于或可能暴露于病毒(例如，hiv感染)。在施用治疗有效量的所公开的治疗组合物之后，可以监测对象的感染(例如，hiv-1感染)、与感染(例如，hiv-1感染)相关的症状、或二者。[0149]对于治疗应用，在疾病或感染的症状发作时或之后(例如在出现感染(例如，hiv-1感染)的症状之后或在诊断感染之后)提供免疫原性组合物。因此，免疫原性组合物可以在预期暴露于hiv病毒之前提供以减弱预期的感染和/或相关的疾病症状的严重性、持续时间或程度；在暴露于或怀疑暴露于病毒之后提供；或在实际感染开始之后提供。[0150]本发明的药物组合物可以与本领域中已知的用于治疗或预防相关病原体的感染(例如，hiv感染)的其他药剂组合。再次，以hiv-1感染为例，这些已知的药剂包括，例如抗体或其他抗病毒药剂，例如核苷逆转录酶抑制剂，例如阿巴卡韦、azt、去羟肌苷(didanosine)、恩曲他滨、拉米夫定、司他夫定、替诺福韦、扎西他滨、齐多夫定等，非核苷逆转录酶抑制剂，例如地拉韦定(delavirdine)、依非韦仑(efavirenz)、奈韦拉平，蛋白酶抑制剂，例如安普那韦(amprenavir)、阿扎那韦(atazanavir)、茚地那韦(indinavir)、洛匹那韦(lopinavir)、奈非那韦、安普那韦(osamprenavir)、利托那韦、沙奎那韦、替拉那韦(tipranavir)等，以及融合蛋白抑制剂，例如恩夫韦地等。药物组合物和已知的抗hiv剂的施用可以同时或先后进行。[0151]本发明的包含如本发明所述的新结构组分的纳米粒疫苗组合物(例如，用锁定结构域稳定的hiv-1疫苗)或药物组合物可以作为药盒(kit)的组分提供。任选地，这样的药盒包含另外的组分，包括包装、说明书和多种其他试剂，例如缓冲液、底物、抗体或配体(例如对照抗体或配体)以及检测试剂。药盒中还可以提供任选的说明书。[0152]实施例[0153]提供以下实施例以对本发明进行举例说明，但不限制本发明。[0154]实施例1：具有多种ld的bg505 gp140纳米粒的产量和纯度[0155]针对具有在表面上展示的hiv-1bg505 ufo三聚体的60聚体e2p和i3-01纳米粒验证了不同锁定结构域(ld)的效用。图6中示意性地描述了构建体设计。将含ld的纳米粒在100ml expicho细胞中瞬时表达，随后使用2g12或pgt145抗体柱纯化。然后在superose 6 10/300gl柱上通过尺寸排阻色谱法(sec)对纳米粒样品的产量和纯度进行表征。sec谱表fisher)过滤。可以使用pgt145抗体亲和柱从培养物上清液中提取纳米粒。质粒dna种可以由我们的实验室制备，并提供给承包商以在承包商的gmp生产设施中进行大规模生产。[0163]实施例5：具有锁定机制的纳米粒疫苗的品质控制[0164]可以通过以下评估cho/expicho产生的纳米粒蛋白的品质：(1)针对产量和纯度的superose 6 10/300gl柱和蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(bn-page)；(2)针对热稳定性的用microcal vp-capillary量热仪(malvem)的差示扫描量热法(dsc)；(3)针对抗原性的使用octet red96、定量生物传感器以及一组bnab和非nab的生物层干涉测量术(bli)；以及(4)针对纳米粒组装和结构完整性的负染色电子显微术(em)。qc过程已在我们的实验室中针对选择的纳米粒构建体进行了验证(参见下文)。值得注意的是，在蛋白质表达、生产和纯化之后，可以在任何gmp设施中容易地在现场执行qc步骤(1)至(2)。[0165]在100ml expicho细胞中瞬时表达并使用pgt145抗体亲和柱从细胞上清液中纯化后，在superose 6 10/300gl柱上通过尺寸排阻色谱法(sec)分析纳米粒(图3a)。在sec谱中观察到在8ml处的单个尖峰，指示这两种构建体的高纯度。此外，基于e2p和i3-01的构建体的uv280值分别达到～450和～350，指示这两种构建体的高产量，估计为15至20mg/l。特别值得注意的是，对于i3-01和e2p，锁定机制不仅可以改善稳定性，还可以改善纯纳米粒的产量，将其提高2至3倍。还通过bn-page分析了sec前纳米粒样品，其在凝胶上未显示出对应于低分子量物质的条带，所有样品由于纳米粒的大尺寸和高分子量而均被捕获在泳道顶部的孔中(图3b)。因此，bn-page证实了在sec分析中观察到的高纯度。[0166]然后通过dsc评估纯化的纳米粒以测量热稳定性，对于基于e2p和i3-01的构建体，其产生的熔融温度(tm)分别为69.52℃和68.26℃，指示与tm＝68.24℃的bg505 ufo三聚体相比更高的热稳定性程度(图3c)。因此，利用锁定机制，tm独立于纳米粒平台，并且仅由展示的抗原(在这种情况下为ufo gp140三聚体)的热稳定性决定。还发现了两种选择的纳米粒构建体对化学物质具有抗性，并且在-80℃至4℃的宽温度范围内稳定。例如，当通过负染色em对冷冻然后解冻的样品或在4℃下保存数周的样品进行分析时，未观察到由于温度变化引起的崩解。[0167]如下所述进一步表征了gmp产生的纳米粒的结构和抗原性。[0168]实施例6：抗原性和免疫原性的评价[0169]除了简单、稳健的制造过程以及卓越的生物化学和生物物理特性外，进一步的体外和体内评价表明，这些具有锁定机制的ufo gp140纳米粒可提供迄今为止最有希望的hiv-1疫苗候选物。[0170]体外评价-抗原和结构分析(或qc步骤3和4)：使用bli和一组5种bnab(图4a)和4种非nab(图4b)评估两种选择的纳米粒的抗体结合。包含ufo三聚体作为对照。总体而言，这两种纳米粒均显示出与识别v2顶点(apex)、n332超位点(supersite)和cd4bs的bnab的显著增强的结合(3至4倍)，但通过35o22与gp120-gp41界面的结合降低，这很可能是由于阻塞了进入纳米粒表面上的该位点。还值得注意的是，纳米粒展示没有提高与cd4bs、cd4i位点和免疫显性gp41表位的非nab结合，而v3顶端(tip)除外，其显示出适度提高的19b结合。[0171]还通过负染色em在结构上分析了两种选择的纳米粒，其显示出良好形成的均质纳米粒，具有从表面突出的天然样ufo gp140三聚体的致密层(图4c)。值得注意的是，在大多数情况下，纳米粒壳内的锁定结构域(ld)在这种低分辨率下不可见。然而，偶尔可以识别从纳米粒表面向内突出的结构，这对应于ld蛋白。[0172]在小动物模型中的体内评价：我们在小鼠和兔中评价了ufo三聚体和纳米粒的子集。在小鼠中，所有三聚体(除支架gp140.681构建体外)均未能引起自体2级nab。铁蛋白纳米粒和i3-01纳米粒设计的早期版本(称为“ufo-padre-i3-01”)在第8周诱导了自体2级nab，对于i3-01观察到更强的应答(图5a)。使用纯化的igg进行tzm-bl hiv中和测定，以消除小鼠血清中的非特异性抗病毒活性。值得注意的是，这是第一次在wt小鼠中观察到env诱导的2级nab应答，而在先前的研究中，bg505sosip三聚体在免疫接种16周后未能在wt小鼠中引起任何自体2级nab应答。还在兔中评价了ufo三聚体和铁蛋白纳米粒的免疫原性，并纵向测量了抗体应答。结果表明，铁蛋白纳米粒在第8周诱导了自体2级nab，而bg505 ufo三聚体还需要2个月才能诱导这种2级nab应答(图5b)。在最近的研究中，zhu实验室用最终的纳米粒构建体之一ufo-e2p-ld4-padre免疫了wt小鼠。在测试的8只小鼠中，一只表现出比其他强得多的2级nab应答，而所有动物在11周时均表现出2级nab应答，在1mg/ml igg浓度下具有50％至95％中和(数据未示出)。因此，即使尚未对具有锁定机制的最终纳米粒疫苗构建体进行体内评估，体内数据也清楚地证明了我们的ufo gp140纳米粒的疫苗潜力。我们预期这两种纳米粒构建体将诱导对那些2级分离物的更广泛和强效的中和抗体应答。[0173]实施例7：用于利用i类融合的其他病毒-丝状病毒的疫苗[0174]我们开发了用于丝状病毒的纳米粒疫苗。丝状病毒例如埃博拉病毒(ebov)和马尔堡病毒可导致人和非人灵长类动物(nhp)中的致死性出血热。尽管丝状病毒已造成过去人疾病的暴发，但埃博拉病毒是造成2013至2016年期间历史上最大的暴发的唯一原因，其蔓延到九个非洲国家，具有28,600例病例和11,325例死亡。当前，刚果民主共和国(drc)正在发生埃博拉爆发，宣称已夺去了超过六百条生命。丝状病毒糖蛋白(gp)通过启动附着和膜融合来介导细胞进入，并且是疫苗设计中的主要靶标。gp可以被分离自人幸存者和免疫动物的中和抗体识别(参见saphire et al.，cell 174(4)：938-952，2018)。[0175]在我们的研究中，我们使用埃博拉病毒的扎伊尔毒株的氨基酸序列(genbank：np_066246)设计了多种gp融合构建体，其包含gp的胞外域(第33至632位氨基酸)，但缺失了非结构化黏蛋白样结构域(mld，第313至463位氨基酸)，因此称为gpδmuc。由于gp的gpδmuc形式已被广泛用于结构研究中(参见lee et al.，nature 454(7201)：177-182，2008)，其为线状病毒疫苗设计提供了合理的基础。我们已经在铁蛋白、e2p和i3-01纳米粒平台上展示了野生型(wt)gpδmuc和gpδmuc的通用ufo(ufog)形式(图8a)。在expicho细胞中瞬时表达后，使用mab100抗体柱(对于铁蛋白和e2p)或mab114抗体柱(对于i3-01)从上清液中提取融合蛋白，然后在superose 6 10/300柱上纯化。总体上，我们观察到了呈递gpδmuc-ufog的纳米粒与呈递wt gpδmuc的那些相比更高的产量和纯度，如通过sec谱指示的(图8b)。对于铁蛋白，与wt gpδmuc-铁蛋白相比，gpδmuc-ufog-铁蛋白显示出更明显的纳米粒峰。对于e2p，wt gpδmuc-e2p显示出纳米粒和未组装蛋白质的峰，而gpδmuc-ufog-e2p主要显示出纳米粒的高峰。对于i3-01，这两种融合构建体均显示在纳米粒组装方面具有困难，在sec谱中具有在15至16ml处的未组装的融合蛋白的高峰。尽管如此，负染色的em仍显示出良好形成的呈递wt gpδmuc三聚体和gpδmuc-ufog三聚体的铁蛋白、e2p和i3-01纳米粒(图8c)。[0176]以前，我们已经系统筛选了hiv-1ufo三聚体呈递e2p和i3-01纳米粒的锁定结构域。在这项研究中，我们系统地筛选了埃博拉gpδmuc-ufog三聚体呈递e2p和i3-01纳米粒的锁定结构域。可以在示意图(图8d，左)中说明锁定机制。为了使具有锁定结构域的60聚体纳米粒的结构可视化，我们构建了e2p纳米粒的原子模型，并将锁定结构域(ld4)和t细胞表位(padre)以逐步方式引入模型中(图8d，右)。在我们的研究中，在expicho细胞中瞬时表达七个gpδmuc-ufog-e2p-ldn构建体(n＝1至7)和五个gpδmuc-ufog-10gs-i3-01-ldn构建体(n＝4/5/7/8/9)。使用mab100抗体柱(针对铁蛋白和e2p)或mab114抗体柱(针对i3-01)从上清液中提取gpδmuc融合蛋白，然后在superose 6 10/300柱上纯化。在所有基于e2p的构建体中，ld4和ld7显示出最高的产量和纯度，而在所有基于i3-01的构建体中，ld7和ld8给出了最佳结果(图8e)。这在很大程度上与我们先前对hiv-1ufo gp140纳米粒的发现一致，其中ld4和ld7显示分别与e2p和i3-01最相容。因此，与展示的免疫原无关，与ld4组合的e2p和与ld7组合的i3-01可用作疫苗开发的两种通用纳米粒平台。[0177]与我们先前对hiv-1gp140纳米粒的观察结果一致的另一个发现是，在锁定结构域的c末端添加t细胞表位显著改善了所得纳米粒(在这种情况下为gpδmuc-ufog纳米粒)的产量和纯度(图8f)。这可以通过在中空纳米粒的中心疏水性t细胞表位簇的形成来解释(图8d，右)。bn-page通过在凝胶上显示高分子量条带进一步证实了纳米粒的组装(图8g)。然而，所有gpδmuc-i3-01融合构建体均显示出未组装的二聚体和单体物质。最后，在elisa中将三种wt gpδmuc纳米粒和三种gpδmuc-ufog纳米粒的抗原谱与其各自的gpδmuc三聚体进行了比较(图8h)。总体而言，gpδmuc纳米粒显示出比gpδmuc三聚体强得多的与中和抗体的结合。[0178]实施例8：用于利用i类融合的其他病毒-沙粒病毒的疫苗[0179]基于相同的设计策略，我们开发了用于沙粒病毒的纳米粒疫苗。还已知沙粒病毒在人中造成严重的出血热。哺乳动物拉沙病毒(lassa mammarenavirus，lasv)是拉沙热的病原体和西非的主要公共卫生负担之一。lasv糖蛋白复合物(gpc)是异二聚体的三聚体，每个异二聚体包含受体结合亚基gp1和跨膜融合介导亚基gp2。与其他i类融合蛋白(例如hiv-1gp160和埃博拉gp)相似，lasv gpc负责细胞进入，并是中和抗体应答的主要靶标之一。当前，没有可用于预防lasv感染的疫苗。最近，已经报道了与人中和抗体复合的lasv gpc的晶体结构(参见hastie et al.，356(6341)：923-928，2017)。[0180]在我们的研究中，我们基于lasv毒株胞外域的氨基酸序列(genbank：np_694870)设计了gpc融合构建体。我们填充了基于中和抗体37.7h的抗体柱(参见hastie et al.，science 356(6341)：923-928，2017)以用于lasv gpc和纳米粒的无标签纯化。设计了两种融合构建体(gpc-10gs-fr和gpc-5gs-e2p-ld4-padre)来测试lasv纳米粒疫苗概念，这将分别导致直径为26.3nm和37.6nm的纳米粒(图9a)。将这两种融合构建体在expicho细胞中瞬时表达，并使用37.7h抗体柱纯化。由于37.7h在底部与lasv gpc三聚体的gp2结合，由于与纳米粒表面上的gp2的受限的接近，因此其对于gpc纳米粒的纯化可能不是最佳的。这解释了对于这两种构建体均观察到的低产量。然而，通过负染色em分析了37.7h纯化的蛋白质，其显示出良好形成的纳米粒与未组装的蛋白质混合(图9b)。由于gpc与铁蛋白纳米粒之间的长柔性接头，因此在铁蛋白纳米粒表面上无法识别gpc刺突(图9b，左)。相反，gpc-5gs-e2p-ld4-padre的em图像的特写镜头示出了e2p纳米粒表面上gpc三聚体的层(图9b，右)。总之，我们的研究证实了lasv gpc可以展示在具有锁定结构域的60聚体纳米粒上，尽管更有效的抗体柱可以进一步改善gpc纳米粒的纯度。[0181]实施例9：用于利用i类融合机制的其他病毒-rsv的疫苗[0182]我们还开发了用于呼吸道合胞病毒(rsv)的纳米粒疫苗。人呼吸道合胞病毒(hrsv)感染是婴儿、幼儿和老年人中细支气管炎和住院的主要原因之一。融合糖蛋白(f)介导细胞进入，并且是用于疫苗设计的主要靶标。f可以被分离自感染的供体的中和抗体识别。就像hiv-1gp160、埃博拉gp和拉沙gpc一样，hrsv f是i类跨膜表面蛋白，其具有n末端的信号肽(第1至25位氨基酸)和在c末端附近的膜锚。f首先作为无活性的前体蛋白f0合成，f0在反式高尔基复合体中通过弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样细胞内切蛋白酶切割而被激活后组装成同三聚体。切割导致两个二硫键连接的nh2-f2-f1-cooh形式的亚基。作为切割的结果，f1的n末端包含融合肽(第137至154位氨基酸)，其是直接插入宿主细胞膜中以触发融合的疏水肽。f1亚基还包含两个七肽重复(hr)区域，其在融合过程中缔合并使病毒膜和细胞膜接近。已经在原子分辨率下确定了与中和抗体复合的融合前f的晶体结构(参见mclellan et al.，340(6136)：1113-1117，2013)。[0183]在我们的研究中，我们在铁蛋白、e2p和i3-01纳米粒上展示了融合前hrsv f，利用e2p和i3-01 60聚体测试了多种锁定结构域和接头。分子建模表明，hrsv f fr纳米粒的尺寸为33.9nm或更大，并且hrsv f e2p(或i3-01)的直径为至少45.2nm(图10a)。我们使用融合前f特异性人中和抗体d25填充了抗体柱以用于hrsvf和f呈递纳米粒的无标签纯化(参见mclellan et al.，340(6136)：1113-1117，2013)。将所有hsv f融合构建体在expicho细胞中瞬时表达。使用d25抗体柱从上清液中提取f融合蛋白，并通过负染色em进行分析。在f的c末端与铁蛋白的n末端之间包含10氨基酸(g4s)2接头的f-10gs-fr构建体形成了在铁蛋白表面上具有可见的“拇指状”融合前f三聚体的纳米粒(图10b)，与分子建模(图10a)一致。然后将融合前f展示在包含锁定结构域(ld4)和t细胞表位(padre)的e2p纳米粒上。测试了在f的c末端与e2p亚基的n末端之间具有和不具有10氨基酸(g4s)2接头的两种构建体。没有长接头，融合前f三聚体在e2p纳米粒表面上呈颗粒状突起(图10c，左)，而具有长接头，则可以在e2p纳米粒表面上识别一系列“拇指状”融合前f三聚体(图13c，右)。最后，将融合前f展示在包含锁定结构域(ld7)和padre的i3-01纳米粒上。产生了具有插入在f与e2p之间(外部)和与ld7的c末端连接(内部)的t细胞表位(padre)的两种构建体，以检查在锁定结构域存在下t细胞表位的位置对纳米粒组装的作用。对于前者(f-5gs-padre-i3-01-ld7)，我们观察到了良好形成的纳米粒，但无法识别纳米粒表面上的融合前f刺突(图11d，左)。对于后者(f-10gs-i3-01-ld7-padre)，尽管存在未组装的f三聚体，我们仍观察到装饰有“拇指状”融合前f三聚体的层的良好形成的纳米粒(图11d，右)。[0184]总之，我们的结果表明，hrsv f可以展示在具有锁定结构域的e2p和i3-01纳米膜上，并提供了使用不同长度的接头并将t细胞表位置于不同位置的实例。[0185]实施例10：用于利用i类融合机制的其他病毒-cov的疫苗[0186]我们还开发了用于冠状病毒(cov)的纳米粒疫苗。cov是具有正链rna基因组的包膜病毒。2002年，亚洲的严重急性呼吸道综合征(sars)的爆发导致发现了一种新型冠状病毒，其后来被命名为sars-cov。在爆发期间，sars-cov感染了超过8000人，致死率为约10％。2012年，鉴定了一种新的冠状病毒物种中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)，其此后在27个国家中感染超过2000人，致死率为约35％。对于这两种冠状病毒，病毒基因组均编码刺突(s)、包膜(e)、膜(m)和核衣壳(n)结构蛋白，其中s蛋白负责通过s1亚基中的受体结合结构域(rbd)与宿主受体结合，以及随后的膜融合和病毒进入。rbd包含核芯亚结构域和受体结合基序(rbm)。虽然这两种冠状病毒之间的核芯亚结构域高度相似，但其rbm显示出不同的受体特异性：sars-cov识别血管紧张素转化酶2(ace2)，而mers-cov结合二肽基肽酶4(dpp4)。对于这两种冠状病毒，s蛋白都负责感染，并且因此是疫苗设计的主要靶标之一。[0187]在我们的研究中，我们在铁蛋白、e2p和13-01纳米粒上展示了mers-cov s三聚体(参见pallesen et al.，pnas，114：e7348-e7357and pdb id：5w9k)，e2p和i3-01构建体中引入了锁定结构域。s构建体来源于特定的mers-cov毒株(genbank：jx869059)。分子建模表明，mers s fr纳米粒的尺寸为34.0nm或更大，并且mers se2p(或i3-01)纳米粒的直径为至少45.2nm(图11a)。我们使用rbd定向中和抗体mca1开发了抗体柱，以用于mers-cov s和s纳米粒的无标签纯化。在expicho细胞中瞬时表达后，使用mca1抗体柱从上清液中提取s融合蛋白，并通过负染色em直接进行分析。在s的c末端与铁蛋白亚基的n末端之间包含10-aa gs接头(seq id no：24)的mers s-10gs-fr形成了具有在表面上可见的大s刺突的纳米粒(图11b，左)。mers s-10gs-e2p-ld4-padre(图11b，中)和s-10gs-i3-01-ld7-padre(图11b，右)形成了具有展示在表面上的二十个s刺突的较大纳米粒。然而，em图像还示出了未组装的s融合蛋白。[0188]为了改善纳米粒上s蛋白的稳定性，我们在s与纳米粒亚基之间插入了“t4纤维蛋白的c末端三聚化基序”或foldon。在通过s-foldon-10gs-fr(图11c，左)和s-foldon-10gs-i3-01-ld4-padre(图11c，右)形成的纳米粒上，可以在em图像中清楚地识别s刺突，证实可以将其他结构组分引入到具有锁定结构域的纳米粒中。[0189]实施例11：用于利用ii类融合机制的病毒-hcv的疫苗[0190]我们在hcv e2核芯纳米粒疫苗的开发中进一步应用了相同的疫苗设计策略。丙型肝炎病毒(hcv)是黄病毒科(flaviviridae)肝炎病毒(hepacivirus)属的小包膜单链正义rna病毒。感染世界人口的1％至2％，hcv是主要的健康负担之一，导致每年约500,000例死亡和每年估计1.5至2百万例新感染。hcv具有高的遗传多样性，并且可分为7种主要基因型和86种亚型。hcv可以经历迅速突变，从而在感染的个体内引起病毒准种以逃避宿主免疫系统。然而，在20％至30％的急性感染患者中的自发病毒清除表明，可以利用通过疫苗接种诱导的有效免疫应答来预防hcv感染。e1和e2包膜糖蛋白在hcv包膜上形成异二聚体，其介导病毒进入宿主肝细胞。作为受体结合蛋白，e2与宿主细胞受体cd81和sr-b1直接相互作用，并且是用于中和抗体的主要靶标之一，所述中和抗体主要通过阻断cd81相互作用来中和hcv。开发了在高度可变区1(hvr1)以及可变区2和3(vr2/3)处具有截短的e2构建体(称为e2核芯)以促进结构分析。与广泛中和抗体ar3c(参见kong et al.，science 342(6162)：1090-1094，2013)复合的来源于分离株h77(基因型1a)的e2核芯以及与中和抗体2a12(khan et a1.，nature，509(7500)：381-384，2014)结合的来源于分离株j6(基因型2a)的截短的e2的晶体结构提供了对hcv包膜糖蛋白的免疫识别的首次见解。然而，目前尚无可用于预防hcv感染的许可疫苗。[0191]在我们的研究中，我们设计了e2核芯纳米粒作为hcv疫苗。我们假设每个在表面上展示24至60个e2核芯的纳米粒均可引起对保守e2表位的有效中和抗体应答，并且因此可展现为有希望的hcv疫苗候选物(图12a)。为了验证该假设，我们测试了三种纳米粒平台24聚体铁蛋白(fr)以及60聚体e2p和i3-01，其导致24.5至37.5nm的e2核芯纳米粒(图12b)。在我们的研究中使用的e2核芯构建体来源于两个分离株h77(基因型1a)和hk6a(基因型6a)的e2的氨基酸序列。在我们的设计中，e2核芯的c末端通过10-gs接头(seq id no：24)与纳米粒亚基的n末端遗传融合。将e2核芯融合构建体在expicho或293f细胞中瞬时表达，并通过ar3c抗体柱随后使用superose 6 10/300gl柱的sec进行纯化(图12c)。对于h77分离株来源的构建体，sec谱显示所有e2核芯纳米粒的高产量和高纯度，对于24和60聚体观察到不同的模式。尽管e2-核芯-10gs-fr产生了对应于聚集体的在8至9ml处的峰，但e2-核芯-10gs-e2p和i3-01构建体二者示出了跟随在纳米粒峰之后的15至20ml处的峰(图12c)。对于hk6a分离株来源的构建体，颗粒产量和纯度的降低伴随着较低分子量物质的增加。通过bn-page和负染色em对sec纯化的e2核芯融合蛋白进行了分析，其分别显示出高分子量条带和均质纳米粒(图12d和12e)。我们观察到对e2核芯纳米粒的增强的抗体结合，如通过最广泛中和抗体的ec50的高至100倍的改变所表明的(图12f)。为了进一步研究多价展示对抗原性的作用，我们使用octet和一小组抗体对h77和hk6a来源的e2核芯纳米粒针对其各自的e2核芯进行了测试(图12g)。对于h77和hk6a来源的纳米粒二者观察到了峰抗体结合信号与抗原价之间的相关性：60聚体>24聚体>单体。[0192]最后，我们检查了e2核芯纳米粒中锁定结构域的使用。为此，我们测试了来源于hcv h77分离株的构建体e2-核芯-10gs-e2p-ld4-padre和e2-核芯-10gs-i3-01-ld7-padre。负染色em显示这两种构建体的干净、均质的纳米粒(图12h)。值得注意的是，e2-核芯-10gs-e2p-ld4-padre由于通过ld4和padre形成的致密内壳而在em图像中显示出实心表面，而没有ld4和padre的其对应物则显示为空心。尽管如此，我们的结果证实了hcv e2核芯可以在具有锁定结构域的纳米粒上展示。[0193]实施例12：用于利用ii类融合机制的病毒-zikv的疫苗[0194]我们还将本文所述的疫苗设计策略应用于寨卡病毒(zikv)diii纳米粒疫苗的开发。zikv是黄病毒科的正链rna病毒，黄病毒科还包括登革热病毒(denv)、西尼罗病毒(wnv)、日本脑炎病毒(jev)和黄热病病毒(yfv)。zikv基因组编码三种结构蛋白(衣壳、prm和包膜)和七种非结构蛋白(ns1、ns2a/b、ns3、ns4a/b和ns5)。2015年和2016年的zikv爆发引起了全世界公共卫生危机。主要通过伊蚊(aedes)种的蚊子传播，zikv可引起成年人的格林-巴利综合征(guillain-barréꢀsyndrome，gbs)和新生儿的小头畸形。已报道了多种基于包膜(e)的疫苗候选物来在小鼠和nhp中预防zikv感染。然而，zikv感染的抗体依赖性增强(ade)和由于已有的抗黄病毒免疫的发病机制引起了对当前疫苗策略的安全性担忧。没有其他更安全更有效的疫苗可用于预防zikv感染。[0195]zikv e蛋白由三个结构域di、dii和diii组成。在这三个结构域中，细长的手指状dii负责e二聚化，并且包含通过病毒和宿主细胞膜的融合触发ph依赖性进入的保守融合环(fl)。diii形成有助于病毒附着的c末端免疫球蛋白(ig)样结构域。从具有或不具有预先暴露于denv的zikv感染的供体已鉴定出了许多中和和非中和抗体。通常，diii定向抗体倾向于是zikv特异性的，并且比di/ii定向抗体更强效地中和。后者通常与denv交叉反应，较差地中和，并且在一些情况下明显增强体内病毒感染。[0196]在我们的研究中，我们设计了基于24聚体铁蛋白(fr)和60聚体e2p和i3-01的diii纳米粒作为潜在的zikv疫苗候选物。diii融合构建体基于来源于非洲毒株mr766(genbank：mk105975)和亚洲毒株beh818995(genbank：ku365777)的e蛋白的diii的氨基酸序列。我们还使用diii定向中和抗体zk2b10(参见yu et al.，jci insight 2(12)：93042，2017)开发了抗体柱，以用于diii纳米粒的无标签纯化。将所有diii-fr融合构建体在expicho细胞中瞬时表达，并通过zk2b10抗体柱纯化。分子建模表明，在表面上具有diii层的60聚体i3-01将得到～35nm的纳米粒(图13a，左)。在sec谱中，我们观察到了对应于良好形成的diii-铁蛋白纳米粒的高峰(图13a，右)。通过bn-page分析了在superose 610/300gl柱上以14ml洗脱的sec级分，其显示出fr纳米粒特征性的高分子量条带(图13b)。负染色em显示出良好形成的diii纳米粒(图13c，左)。然而，由于diii的小尺寸和使用了柔性10gs接头，因此我们无法识别纳米粒表面上的diii。根据相同的方案，我们产生了i3-01和e2p融合蛋白，并且通过负染色em评估了其纳米粒组装(图13c，中间和右)。虽然可以在em图像中容易地看到diii-10gs-i3-01纳米粒，但e2p显示难以进行纳米粒组装，导致低产量。[0197]最后，我们检查了锁定机制是否可以进一步改善diii在i3-01纳米粒上的展示。实际上，负染色em显示出在expicho细胞中以高产量和高纯度产生的均质diii-10gs-i3-01-ld7-padre纳米粒(图13d)。总之，我们已经成功地在多种纳米粒平台上展示了zikv diii，并且对于包含锁定结构域ld7和t细胞表位padre的i3-01纳米粒构建体观察到了最佳特性。[0198]实施例13：用于非病毒靶标的疫苗开发-疟疾疫苗[0199]我们已经将我们的疫苗研究进一步扩展到胞内病原体，例如恶性疟原虫(疟疾)和结核分枝杆菌(tb)，以及人蛋白质，例如前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)。我们的主要假设是，纳米粒展示将增强对胞内病原体的免疫应答，并破坏对人蛋白质的免疫耐受性。将抗体和t细胞应答作为关键的免疫学读数进行了测量。[0200]疟疾疫苗。恶性疟原虫是单细胞原生生物寄生虫，其在人中引起疟疾，一种威胁生命的疾病。恶性疟原虫可以通过被感染的雌性按蚊(anopheles)的叮咬传播给人。2017年，恶性疟原虫在87个国家中感染了估计2.19亿人，约435,000例疟疾相关的死亡。尽管可以治疗疟疾，但目前尚无用于预防恶性疟原虫感染的许可疫苗。在我们的研究中，我们基于对这种寄生虫的生命周期重要的三种抗原pfs25、环子孢子蛋白(csp)和网织红细胞结合蛋白同源物5(pfrh5)开发了疟疾纳米粒疫苗。[0201]第一种抗原pfs25是在寄生虫的合子和动合子形式的表面上表达的25kda的性阶段抗原。抗pfs25抗体可阻止蚊媒的中肠中恶性疟原虫卵囊的发育。目前，pfs25是最成熟的传播阻断疫苗(tbv)候选物，并已在人体临床试验中进行了测试。通过由用佐剂montanide isa 51中可溶性pfs25的人疫苗接种诱导的抗pfs25抗体在标准膜饲喂测定(smfa)中具有作用，并阻止恶性疟原虫的实验室和野外分离株二者的发育。已经确定了与从人源化小鼠中分离的单克隆抗体复合的pfs25的结构(参见scally et al.，nat commun，8∶1568，2017)，为合理疫苗设计提供了基础(图14a)。[0202]我们已经测试了两种抗-pfs25抗体fab1260和fab1269(图14b)从细胞上清液中纯化pfs25的能力。基于elisa数据，选择fab1260填充抗体柱以用于pfs25纳米粒的无标签纯化。我们还设计了“颈部”区域，以促进具有平坦的l形结构的pfs25在纳米粒表面上的多价展示(图14c)。更具体地，将来源于病毒蛋白的三螺旋束在具有或不具有接头的情况下插入pfs25与纳米粒亚基之间(图14c)。结合多种纳米粒平台测试了来源于亨德拉病毒结构域(pdb id：4heo)和麻疹病毒结构域(pdb id：1oks)的两种螺旋束，称为“neck1”和“neck2”。将所有融合构建体在expicho细胞中表达，随后使用fab1260抗体柱纯化。将fab1260纯化的融合蛋白通过负染色em进行表征，其示出了针对仅含neck1的构建体的纳米粒(图14d)。具体地，pfs25-neck1-10gs-fr纳米粒显示出最高的产量和纯度，如通过em指示的(图14d，左)。pfs25-neckl-e2p-ld4-padre构建体显示产生了良好形成的纳米粒和聚集体的混合物(图14d，中间)。pfs25-neck1-10gs-i3-01-ld7-padre构建体以与铁蛋白构建体类似的高纯度但是略低的产量产生了纳米粒(图14d，右)。该结果与以下事实一致：围绕每个3次对称轴的i3-01的n末端具有5nm的大间距，其适合于展示大的不规则形状的蛋白质，例如pfs25。总之，pfs25可以展示在具有锁定结构域和t细胞表位的60聚体纳米粒上。[0203]第二种抗原环子孢子蛋白(csp)是疟原虫寄生虫子孢子阶段的分泌蛋白，对子孢子功能和肝细胞的入侵至关重要。csp是rts，s疫苗(mosquirixtm)中使用的抗原，该疫苗目前正处于人临床试验中。作为临床上最先进的疫苗候选物，rts，s/as01(rts，s)已显示在儿童中提供针对疟疾的部分保护。csp包含含有信号肽序列和结合硫酸肝素蛋白聚糖并具有保守的蛋白水解切割位点的区域i的n末端区域；包含四氨基酸基序nanp或nvdp的许多重复的中央区域；以及包含区域ii[血小板反应蛋白(tsp)样结构域]和典型糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定添加序列的c末端区域(图15a，顶部)。rts，s疫苗包含来自csp的189个氨基酸(第199至387位氨基酸)，包括最后18个nanp重复序列和不包含gpi锚定添加序列的c末端，与乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)连接(图15a，底部)。[0204]在我们的研究中，我们采取了逐步策略来设计具有锁定结构域的csp纳米粒疫苗(图15b)，即，我们在纳米粒上展示了csp蛋白的最小b细胞表位(步骤1)、全长b细胞表位(步骤2)、全长b细胞表位加上c末端t细胞表位(步骤3)和rts，s抗原(步骤4)。为了能够进行无标签纯化，我们使用fab1450填充了抗体柱，对于其已确定了具有nanp(seq id no：27)重复的复杂结构(图15a，左下)。将所有csp融合构建体在25ml expicho细胞中瞬时表达，随后进行fab1450纯化和负染色em分析。在步骤1中，我们在两种纳米粒上展示了最小b细胞表位，5个nanp重复(nanp5)。我们对于所有测试的构建体均观察到了极高的产量。负染色em显示高纯度nanp5-5gs-fr和nanp5-10gs-fr纳米粒，而没有任何其他蛋白质物质(图15c，左和中)。我们还表达了nanp5-5gs-padre-i3-01-ld7构建体，其以高产量和高纯度形成了均质纳米粒(图15c，右)。因此，我们的结果证实了fab1450抗体柱的效用以及具有和不具有锁定结构域的nanp5纳米粒组装。在步骤2中，我们在三种纳米粒平台上展示了rts，s疫苗抗原nanp19中的全长b细胞表位以用于负染色em分析(图15d)。尽管nanp重复的数目显著增加，但是所有构建体均形成具有高产量和高纯度的均质纳米粒。因此，我们的结果证实了具有和不具有锁定结构域的nanp19纳米粒组装。[0205]在步骤3中，我们设计和表征了六种融合构建体，其全部包含全长b细胞表位nanp19和c末端t细胞表位αtsr结构域以及其之间的5gs接头(seq id no：17)。负染色em证实nanp19-5gs-αtsr可以成功展示在具有和不具有锁定结构域的所有三种纳米粒平台上(图15e)。由于nanp19-5gs-αtsr包含了rts，s抗原中所有在结构和功能上确定的组分，并且仅在接头上有所不同，因此两种抗原应具有相同的特征。[0206]我们进一步利用sec评估了在25ml expicho细胞中产生的这些nanp19-5gs-αtsr纳米粒的产量和纯度(图15f)。与em数据一致，nanp19-5gs-αtsr纳米粒显示出高纯度，如通过sec谱中的单峰指示的。在产量方面，我们观察到了纳米粒特异性模式：fr>e2p>i3-01。总之，我们基于csp的结构和抗原组分的多种组合开发了一系列疟疾疫苗候选物，其全部可以展示在具有锁定结构域的60聚体纳米粒上。[0207]第三抗原恶性疟原虫网织红细胞结合蛋白同源物5(pfrh5)是红细胞入侵所需的裂殖子黏附素。通过与红细胞表面蛋白basigin(也称为cd147和emmprin)的相互作用，pfrh5是唯一证明对所有测试毒株的红细胞入侵都是必需的成员(参见wong et al.，nature 565：118-121，2019)。已经确定了pfrh5的晶体结构(参见wright et al.，nature 515：427-430，2014)。我们还基于抗体9ad4和qa1开发了抗体柱，以用于pfrh5和pfrh5纳米粒的无标签纯化。我们设计了融合构建体以在具有和不具有锁定结构域的纳米粒上展示pfrh5。[0208]实施例14：用于非病毒靶标的疫苗开发-结核病疫苗[0209]结核病(tb)是由结核分枝杆菌细菌引起的潜在的严重传染病，其主要感染肺。感染了全世界人口的25％，tb在2017年造成高至1000万例疾病病例，导致130万例死亡。尽管卡介苗(bacille calmette-guérin，bcg)疫苗已在tb很普遍的国家广泛使用，但其并未提供针对tb的全面保护。已经开发了许多针对结核分枝杆菌的新型结核病疫苗候选物，其目前处于人临床试验中(参见khoshnood et al.int.j.biol.macromol.120：180-188，2018)。[0210]在我们的研究中，我们在纳米粒上展示了两种tb抗原。第一种抗原ag85复合物通过催化霉菌酸转移到细胞壁阿拉伯半乳聚糖并通过合成海藻糖二霉菌酸酯(索状因子)来维持细胞壁的完整性。ag85是高度免疫原性的，并且可以诱导强效的t细胞和抗体应答。最新的疫苗试验报告了bcg疫苗接种后婴儿中针对ag85a的升高的抗体滴度，并且更重要的是，ag85a特异性igg与降低的tb风险相关。我们已经在hek293 f细胞中分别表达了ag85a、ag85b和ag85c，并且观察到ag85a和ag85b的良好折叠单体，但观察到ag85c的三聚体蛋白。我们设计了融合构建体，以在具有和不具有锁定结构域的纳米粒上展示ag85a、ag85b和ag85c。由于尚未报道针对ag85的抗体，因此我们利用噬菌体展示技术鉴定了ag85结合抗体，以用于ag85a、ag85b和ag85c纳米粒的无标签纯化。[0211]第二种抗原mtb72是由mtb32和mtb39构成的融合蛋白。mtb72已与gsk佐剂as01组合使用，并在临床试验中显示出54.0％的效力(参见meeren et al.，n.engl.j.med.，379：1621-1634，2018)。我们已经在hek293f细胞中将mtb32和mtb39表达为单独的抗原，并观察到相对较低的产量。我们设计了在具有和不具有锁定结构域的纳米粒上展示的具有mtb32和mtb39的融合构建体。我们已经进行了噬菌体文库筛选，以选择用于填充抗体柱的抗体。由于这些tb抗原是类似于hcv e2和zikv diii的单体(ag85a、ag85b和mtb32)或类似于hiv-1env和埃博拉gp的三聚体(ag85c和mtb39)，因此所得的tb纳米粒表现出大致相似的特性。[0212]实施例15：针对非病毒靶标的疫苗开发-pcsk9疫苗[0213]两种类型的脂蛋白携带胆固醇进出细胞：低密度脂蛋白(或ldl)和高密度脂蛋白(或hdl)。由于ldl导致动脉中的脂肪堆积，因此ldl胆固醇被认为是“坏”胆固醇。血液中ldl胆固醇水平升高与心血管疾病的风险增加相关，心血管疾病是西方国家过早死亡的常见原因之一。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(pcsk9)通过控制ldl受体(ldl-r)的降解来调节血清ldl胆固醇(ldl-c)。pcsk9是一种74kda的丝氨酸蛋白酶，其包含三个结构域：n末端前结构域、枯草杆菌蛋白酶样催化结构域和c末端富含半胱氨酸/组氨酸的结构域(ctd)(图16a)。pcsk9经历了自催化切割，但14kda的前结构域仍非共价地附着于催化结构域，并使蛋白酶失活。已经发现功能丧失的pcsk9突变与较低的ldl胆固醇浓度和降低的心脏病风险相关。由于这些功能丧失突变不会引起有害的副作用，因此疫苗诱导的抗体对pcsk9的抑制是用于降低ldl胆固醇浓度的有吸引力的治疗策略。解析了与多种配体复合的全长和截短的pcsk9的晶体结构，为疫苗设计提供了合理的基础(图16a)。[0214]在我们的研究中，我们在具有或不具有锁定结构域的所有三种纳米粒平台上展示了pcsk9。由于pcsk9的大尺寸和不规则形状，我们采用了与pfs25纳米粒中所使用的相似的“颈部”设计(图16b)。简单地说，将病毒来源的三螺旋束(亨德拉病毒结构域)在pcsk9与纳米粒亚基之间插入构建体中。我们已使用由辉瑞公司开发的强效抗pcsk9抗体j16填充了抗体柱(参见liang et a1.，j pharm exp ther，340(2)：228-236，2012)，以用于pcsk9和pcsk9纳米粒的无标签纯化。在expicho细胞中瞬时表达后，通过j16抗体柱从上清液中提取融合蛋白，并通过负染色em进行分析。我们首先测试了没有颈部设计的两种融合构建体(图16c)。尽管pcsk9-10gs-fr形成均质的纳米粒(图16c，左)，但pcsk9-5gs-padre-i3-01-ld7未能组装，可能是由于pcsk9的大尺寸和不规则形状(图16c，右)。然后，我们表达了包含neck1的纳米粒构建体(图16d)。尽管两种铁蛋白构建体均形成纳米粒，但是在neck1与铁蛋白之间具有较长接头的pcsk9-10gs-neckl-10gs-fr以更高的产量和纯度产生了纳米粒(图16d，图1和2)。尽管在两个em图像中均观察到未组装的融合蛋白，但是具有展示在外部并且与锁定结构域(ld7)的c末端融合的padre的两种i3-01构建体形成了形态稍有不同的纳米粒(图16d，图3和图4)。[0215]总之，pcsk9可以在具有颈部结构域、锁定结构域和t细胞表位padre的60聚体i3-01以及24聚体铁蛋白上展示，提供比pcsk9作为纳米粒更有效的疫苗候选物能够打破自我耐受并诱导更高滴度的抗体应答。[0216]***[0217]因此，已经参考上述代表性实施方案对本发明进行了广泛的公开和说明。应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行多种修改。[0218]还应注意，本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请均通过引用整体地并出于所有目的明确地并入于此，如同各自单独地被如此指出。在与本公开内容中的定义相抵触的程度上，排除了通过引用并入的文本中包含的定义。