一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂及其制备方法及应用与流程

本技术涉及生物防治，更具体地说，它涉及一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂及其制备方法及应用。

背景技术：

1、嗜水气单胞菌是一种革兰氏阴性的条件致病菌，当水体洁净无污染时，一般不致病，而当水质恶化时，其菌体毒力提升，其会产生许多致病物质，如几丁质酶、胞外蛋白酶、脂酶等多种酶和溶血毒素、肠毒素、细胞毒素等外毒素。嗜水气单胞菌是水产养殖过程中最常见也是危害最大的致病菌之一，水产动物一旦被感染会出现胃肠道出血，体表溃烂流血等症状。且病原菌会随着被感染动物的身体、排泄物等继续在养殖池内传播，继续造成污染，导致养殖动物成片死亡。

2、目前我国针对细菌性水产病害的防治手段依然主要依赖抗生素等化学药物，抗生素治疗等措施能够达到部分控制疾病发生、促进养殖动物生长的目的，但由此带来的病原微生物耐药性、药物残留、水环境污染和水产品质量安全等问题越来越严重；同时，由于这些药物的长期使用，在杀灭病原生物的同时也损坏了养殖动物皮肤、肠道等所拥有的正常微生物屏障，使那些原来被正常菌群屏障所抑制的内源性病原菌或外源性病原菌得以大量繁殖，摧毁养殖动物表皮和肠道正常微生物群的微生态平衡，造成养殖动物疾病发生情况雪上加霜。

3、目前嗜水气单胞菌的防治方法主要为抗生素防治、中草药防治和疫苗防控，抗生素防治会带来病原微生物的耐药性、药物残留、水环境污染和水产品质量安全等问题，中草药防治虽然无残留、无抗药性、无环境污染，但不同的中草药提取加工方法对病原菌的抑菌作用存在影响，疫苗防控中存在嗜水气单胞菌血清型众多基体免疫应答水平较低，会产生免疫保护效果差货不稳定的问题。因此利用自然环境中的益生菌抑制病原菌，防治养殖动物的病原侵袭，控制病害发生，即生物防治逐渐成为研究热点。

4、但益生菌对环境的耐受力差，在低ph胃液和高浓度胆盐的作用下，易失去活力，而难以在肠道粘膜上定殖并大量存活，因此易影响益生菌对在水产养殖中对嗜水气单胞菌的防治效果。

技术实现思路

1、为了提高益生菌对水产养殖中嗜水气单胞菌的防治效果，本技术提供一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂及其制备方法。

2、第一方面，本技术提供一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂的制备方法，采用如下的技术方案：

3、一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

4、将解淀粉芽孢杆菌hp-j2按照1-2％的接种量接种到液体培养基中，在35-37℃活化14-15h，然后在4-5℃下离心，用无菌生理盐水洗涤2-3次，加入无菌生理盐水，制得菌悬液；

5、将沸石粉加入到表面活性剂溶液中，在37-40℃下振荡40-48h，洗涤、干燥，制得预处理沸石粉；

6、将所述预处理沸石粉和所述菌悬液按照1:2-3的质量比混合，调节ph值为7-7.5，在37-40℃下振荡3.5-4h，过滤，干燥，制得改性沸石粉；

7、将多孔淀粉、明胶和浒苔多糖加入到去离子水中，搅拌均匀，制得共混液，将共混液和改性沸石粉按照1:0.1-0.2的质量比混合，经喷雾干燥，制得微生物菌剂。

8、通过采用上述技术方案，解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌的代谢物，其具有广谱抗菌和抗真菌活性，可以抑制多种病原微生物的生长，产生的脂肽累抗生素和寡肽酶类可以破坏病原微生物的细胞壁，抑制其生长繁殖，而且解淀粉芽孢杆菌还能产生一些抗生素样物质，对一些真菌病害具有特异性抑制作用，其是一种存在于自然中的细菌，安全性高，不会对环境和生态系统造成负面影响，具有更好的环境友好性，而且其能改善水质，增强酶活性，促进鱼类生长，降低死亡率；沸石表面结构凹凸不平，表面和内部都存在很多大小不均一的孔道，而且由于沸石粉中存在许多孔隙和孔道，以及表面存在的大量微孔，使得其比表面积非常大，因此对于微生物菌体解淀粉芽孢杆菌的吸附更加容易进行；使用表面活性剂对沸石粉进行预处理，能改善沸石粉表面电荷分布，增加沸石粉与菌体之间的吸附力，吸附于沸石粉中的解淀粉芽孢杆菌在经过胃液和肠道时，不易被酸性胃液和高盐度胆液影响而失去活力，沸石粉能改善解淀粉芽孢杆菌的耐受力；最后采用多孔淀粉、明胶、浒苔多糖等形成的共混液对负载有解淀粉芽孢杆菌的沸石粉共混，经喷雾干燥，形成以改性沸石粉为核，以明胶、多孔淀粉和浒苔多糖共混物为壳的微生物菌剂；浒苔是一种大型海洋绿藻，近年来浒苔绿潮爆发对生态环境的不利影响引起广泛关注，对浒苔的生长控制和利用成为研究热点，浒苔中含有大量具有丰富硫酸基和羧酸基等活性官能团的杂多糖，但浒苔多糖的分子结构也会导致其交联困难，所以采用多孔淀粉、明胶与其配合，多孔淀粉和明胶具有很好的相容性，所形成的囊壁较为致密，孔隙率较低，比表面积较小，吸附性能有待提升，因此加入浒苔多糖能优化囊壁孔道结构，进一步增加对解淀粉芽孢杆菌的保护，改善其耐受力，不受胃液和肠液的影响，使解淀粉芽孢杆菌在鱼类胃肠道粘膜上定殖并大量存活，同时由于浒苔多糖中富含硫酸基、羧基等活性官能团，引入更多的吸附位点，提高了对水质的净化能力，而且浒苔多糖能显著增加肠道淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性，提高血清、肝脏、头肾和肠道酸性磷酸酶活性，还能促进鱼类肠道中有益菌相对丰度的增加，通过诱导相关通路调节鱼类免疫能力和提高抗氧化能力；

9、可选的，所述共混液中，多孔淀粉、明胶、浒苔多糖和去离子水的质量比为1:0.56-0.6:0.22-0.3:14-15。

10、通过采用上述技术方案，采用以上质量比的各原料制成共混液，经喷雾干燥后，能在改性沸石粉上形成具有一定孔隙率的外壳，从而降低解淀粉芽孢杆菌在胃液和肠液中的失活，并使微生物菌剂具有一定的吸附能力，能净化水质。

11、可选的，所述多孔淀粉由以下方法制成：

12、将淀粉用蒸馏水溶解，制成浓度为15-18wt％的淀粉悬浊液，在100-110℃下搅拌8-10min，加入聚乙二醇，搅拌均匀后，冷却至4-6℃后保温10-12h，研磨，在叔丁醇中浸渍、过滤、真空冷冻干燥，研磨，制得预处理粉末，淀粉与聚乙二醇的质量比为1:0.2-0.3；

13、将预处理粉末在浓度为2-5wt％的聚乙烯亚胺的甲醇溶液中浸渍20-24h，过滤、洗涤、干燥，制得多孔淀粉。

14、通过采用上述技术方案，淀粉悬浊液经加热搅拌后，不断糊化，然后加入聚乙二醇，溶解后制得多孔淀粉，聚乙二醇中羟基的组偶用，使得不同的淀粉分子经过“架桥”作用彼此相连，有利于网络结构的成长，同时聚乙二醇会包覆在淀粉分子团簇的表面，使得网络结构的成长受阻，使得比表面积变化不规律，制成的多孔淀粉表面布满空隙，孔径大小不一，使得淀粉颗粒形成疏松的三维网络结构，该网络结构能够使有效官能团充分暴露，增加吸附位点；聚乙烯亚胺具有较高的反应活力，表面含有大量的亲水基团氨基和疏水基团乙烯基，在接近中性的溶液富含正电荷，其表面的氨基与淀粉中聚乙二醇的羟基反应液并交联聚合，从而在聚乙二醇上接枝，使得聚乙烯亚胺的亲水性降低，疏水性提升，从而降低在胃液和胆液中的分解，而且在水中作为聚合物阳离子存在，可以中和并吸附所有的阴离子物质，还能螯合重金属离子，改善水质。

15、可选的，所述表面活性剂包括质量比为1:0.2-0.4的十二烷基三甲基溴化铵和羧甲基纤维素。

16、通过采用上述技术方案，对于天然沸石粉来说，其骨架结构中铝对硅的替换导致的负电荷骨架，使其表面带有负电荷，而益生菌达到等电点时的ph值约为3-4，正常情况下，益生菌表面是带有负电荷的，所以益生菌与天然沸石二者的表面接触需要克服静电斥力，阳离子表面活性剂改性后的沸石粉，对解淀粉芽孢杆菌的吸附效果较好，因为阳离子表面活性剂其结构中含有的亲水基团是真电荷基团，它们作为改性剂时，能与孔道内的阳离子发生交换，覆盖在沸石表面，改善沸石表面电荷结构，沸石粉对解淀粉芽孢杆菌的吸附能力得到改善，羧甲基纤维素则能改善沸石粉与解淀粉芽孢杆菌直接的负载粘性，增加负载牢度。

17、可选的，所述表面活性剂溶液的浓度为0.6-0.8wt％。

18、通过采用上述技术方案，表面活性剂浓度过大，会在沸石粉表面形成不同的吸附结构，不利于解淀粉芽孢杆菌的吸附，而且浓度越大，对菌体的毒性越大，菌体不易生长。

19、可选的所述喷雾干燥时，进风温度为160-165℃，进风流速为8-10m3/min，进料量为9.5-9.7ml/min。

20、通过采用上述技术方案，将共混液和改性沸石粉混合后，以适宜的温度、进风流速和进料量进行喷雾干燥，使明胶、多孔淀粉和浒苔多糖能形成均匀的外壳，对解淀粉芽孢杆菌进行保护，若温度过高，使得喷雾干燥时水分急剧蒸发，促使外壳表面出现裂纹，使得解淀粉芽孢杆菌的保护效果下降，而进风流速太小，会导致雾滴分散不均一，并且外壳的孔隙率减小，使得改性沸石粉裸露，造成解淀粉芽孢杆菌的保护效果减弱；进料量过大，物料雾化后来不及干燥，液体对微生物菌剂产生桥连作用，使得粒径增大，包覆保护效果减弱。

21、可选的，所述菌悬液的浓度为(3.6-8.2)×109cfu/g。

22、通过采用上述技术方案，菌悬液浓度较高，从而在与预处理沸石粉共混时，负载更多量的解淀粉芽孢杆菌在预处理沸石粉上。

23、第二方面，本技术提供一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂，采用如下的技术方案：

24、一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂，由所述含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂的制备方法制成。

25、第三方面，本技术提供一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂的应用，采用如下的技术方案：

26、一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂的应用，用于抑制嗜水气单胞菌水产养殖的饲料，添加量为基础饵料的3-6％。

27、第四方面，本技术提供一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂的应用，采用如下的技术方案：

28、一种含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂的应用，用于水产养殖水质改良剂。

29、综上所述，本技术具有以下有益效果：

30、1、由于本技术采用表面活性剂对沸石粉进行预处理，然后再用预处理沸石粉对解淀粉芽孢杆菌进行负载，制得改性沸石粉作为芯材，然后以多孔淀粉、明胶和浒苔多糖作为外壳，制得微生物菌剂，不仅对肠液和胃液的耐受力好，能在鱼类胃肠道粘膜上定殖并大量存活，从而对嗜水气单胞菌起到抑制作用，以防嗜水气单胞菌疾病的发生，而且还能净化水质，改善水体环境。

31、2、本技术中优选采用淀粉和聚乙二醇、聚乙烯亚胺制备多孔淀粉，能形成具有较高比表面积的网络结构，而且通过在聚乙二醇上接枝聚乙烯亚胺，改善对阴离子的吸附作用，增加对水质的净化效果，并且改善多孔淀粉的疏水性，增加对胃液和肠液的耐受力。