蓝细菌CRISPRa系统的构建方法及其在异戊烯醇生物合成中的应用

本发明涉及生物，特别涉及一种蓝细菌crispra系统的构建方法及其在异戊烯醇生物合成中的应用。

背景技术：

1、蓝细菌是光合作用研究的一种模式生物，它们与高等植物一样能够进行产氧光合作用、固定co2，为生物圈提供重要的初级生产力。通过蓝细菌的光合固碳过程，可以将太阳能和co2直接转化为燃料和化学品，同时起到固碳减排和生物合成的作用，因此引起了重点关注。通过对蓝细菌进行代谢工程改造，已经实现从co2到数十种燃料及化学品的生物合成，展示出蓝细菌光合生物技术的重要潜力。

2、近年来蓝细菌遗传操作工具的开发取得了一定的进展，包括基因表达调控相关的启动子与核糖体结合位点的挖掘以及核糖开关的应用。随着crispr技术的发展，它在蓝细菌中的应用也受到了关注。目前在蓝细菌中已建立对基因进行插入、删除及碱基替换的crispr基因编辑技术，研究者们也利用失去dna切割功能的dcas9或dcas12a在蓝细菌中建立了抑制基因表达的crispr干扰(crispr interference，crispri)系统。然而，蓝细菌中激活基因表达的crispr激活(crispr activation,crispra)系统尚未建立，如何选择到适于调控的元件在本领域中存在难度。事实上，细菌中crispra技术的报道仍然较少，目前只有在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)少数几种模式细菌中建立了该技术。因此，开发高效的蓝细菌基因调控工具对于蓝细菌系统与合成生物学研究具有重要意义。

技术实现思路

1、基于以上研究现状，本发明的目的是在蓝细菌中建立一种crispr激活(crispractivation，crispra)系统，利用该系统实现蓝细菌中单基因的高表达、多基因的同时激活以及不同基因的同时激活和抑制，并将其应用于一种重要生物燃料—异戊烯醇的生物合成途径的工程改造。

2、在本发明的第一方面，提供一种建立蓝细菌crispra系统及调控目的基因表达的方法，包括：以蓝细菌转录激活蛋白rpoz(rna聚合酶ω亚基)建立crispra系统，利用该crispra系统激活目的基因表达。

3、在一种或多种优选实施方式中，所述crispra系统包括以下模块：(1)dcas9与转录激活蛋白rpoz；(2)sgrna，其靶结合位点位于目的基因的转录起始位点上游-500至+1bp范围；较佳地，其靶结合位点位于目的基因的转录起始位点上游-420至-240bp范围；更佳地，其靶结合位点位于目的基因的转录起始位点上游-397bp至-273bp范围。

4、在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述dcas9与转录激活蛋白rpoz融合表达。

5、在一种或多种优选实施方式中，所述dcas9与转录激活蛋白rpoz之间包括连接肽(如但不限于：caggggsggggs)。

6、在一种或多种优选实施方式中，转录激活蛋白rpoz融合在dcas9的c端。

7、在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述dcas9与转录激活蛋白rpoz的编码基因在引入蓝细菌细胞时，以含有其的表达框替换内源rpoz基因；或以含有其的表达框插入到蓝细菌染色体的中性位点nsiii。

8、在一种或多种优选实施方式中，(2)中，所述sgrna在引入蓝细菌细胞时，以含有其的表达框插入到蓝细菌染色体的中性位点nsii。

9、在一种或多种优选实施方式中，通过设计同源臂的方法来进行内源rpoz基因的替换，或进行表达框在中性位点nsiii或nsii中的插入。

10、在一种或多种优选实施方式中，dcas9与转录激活蛋白rpoz的表达框中包括启动子和终止子；较佳地，所述启动子包括：化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)中cas9内源的启动子pendo；所述终止子包括trrnb。

11、在一种或多种优选实施方式中，sgrna的表达框中包括启动子和终止子；较佳地，所述启动子包括pcpc；所述终止子包括trrnb。

12、在一种或多种优选实施方式中，所述目的基因包括(但不限于)：功能基因，结构基因。

13、在一种或多种优选实施方式中，所述目的基因包括(但不限于)：酶基因，调控基因，报告基因。

14、在一种或多种优选实施方式中，所述目的基因的表达框与sgrna的表达框连接。

15、在一种或多种优选实施方式中，cas9来自于化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)，所述dcas9由cas9改造获得。

16、在一种或多种优选实施方式中，所述报告基因为荧光蛋白基因；较佳地为gfp，如sfgfp。

17、在一种或多种优选实施方式中，所述目的基因的表达框中包括启动子和终止子。

18、在一种或多种优选实施方式中，所述启动子包括集胞藻pcc 6803 50s核糖体蛋白l10(sll 1745)基因的启动子p18082；所述终止子包括trrnb。

19、在一种或多种优选实施方式中，所述目的基因包括报告基因，该报告基因反映所述蓝细菌crispra系统对目的基因表达的调控(包括激活或抑制)性能。

20、在一种或多种优选实施方式中，所述目的基因为参与生物合成的酶基因，较佳地为生物合成中的限速基因。

21、在一种或多种优选实施方式中，所述酶基因包括核苷三磷酸酶(nucleosidetriphosphatase)基因(nudi)和/或脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase)基因(dxs)。

22、在一种或多种优选实施方式中，所述方法还包括调节蓝细菌中内源基因的转录或表达；较佳地，下调的内源基因编码影响生物合成中竞争途径上的关键酶(减少目标产物被转化为其它产物或副产物)；较佳地，所述生物合成为异戊烯醇的生物合成，所述内源基因是编码香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase，gpps)基因(gpps)；更佳地，以crispri转录干扰系统靶向抑制所述内源基因；更佳地，所述crispri转录干扰系统包括crrna(较佳地其表达框包括pj231119启动子)，靶向于编码香叶基焦磷酸合成酶基因转录起始位点下游+960bp位置。

23、在本发明的另一方面，提供一种调控目的基因表达的蓝细菌crispra系统，其包括以下模块：(1)dcas9与转录激活蛋白rpoz；较佳地，dcas9与转录激活蛋白rpoz融合表达；较佳地，转录激活蛋白rpoz融合在dcas9的c端；(2)目的基因；较佳地，所述目的基因包括(但不限于)：功能基因，结构基因；较佳地，所述目的基因包括(但不限于)：酶基因，调控基因，报告基因；(3)sgrna，所述sgrna靶结合位点位于目的基因的转录起始位点上游-500至+1bp范围；较佳地，所述sgrna靶结合位点位于目的基因的转录起始位点上游-420至-240bp范围；更佳地，所述sgrna靶结合位点位于目的基因的转录起始位点上游-397bp至-273bp范围。

24、在一种或多种优选实施方式中，所述蓝细菌crispra系统中，dcas9与转录激活蛋白rpoz的表达框中包括启动子和终止子；较佳地，所述启动子包括：化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)中cas9内源的启动子pendo；所述终止子包括trrnb。

25、在一种或多种优选实施方式中，所述蓝细菌crispra系统中，sgrna的表达框中包括启动子和终止子；较佳地，所述启动子包括pcpc；所述终止子包括trrnb。

26、在一种或多种优选实施方式中，所述蓝细菌crispra系统中，所述目的基因的表达框中包括启动子和终止子；较佳地，所述启动子包括集胞藻pcc6803 50s核糖体蛋白l10(sll 1745)基因的启动子p18082；所述终止子包括trrnb；较佳地，所述目的基因的表达框与sgrna的表达框连接。

27、在一种或多种优选实施方式中，所述蓝细菌crispra系统中，所述目的基因包括报告基因，该报告基因反映所述蓝细菌crispra系统对目的基因表达的调控(包括激活或抑制)性能。

28、在一种或多种优选实施方式中，所述蓝细菌crispra系统中，所述目的基因为参与生物合成的酶基因，较佳地为生物合成中的限速基因；较佳地，所述酶基因包括核苷三磷酸酶(nucleoside triphosphatase)基因(nudi)和/或脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase)基因(dxs)。

29、在一种或多种优选实施方式中，所述蓝细菌crispra系统中，所述蓝细菌中影响生物合成中竞争途径上的关键酶被下调；所述生物合成为异戊烯醇的生物合成，所述内源基因是编码香叶基焦磷酸合成酶基因(gpps)；更佳地，以crispri转录干扰系统靶向抑制所述内源基因；更佳地，所述crispri转录干扰系统包括crrna(较佳地其表达框包括pj231119启动子)，靶向于编码香叶基焦磷酸合成酶基因转录起始位点下游+960bp位置。

30、在本发明的另一方面，提供所述的调控目的基因表达的蓝细菌crispra系统的应用，用于建立蓝细菌crispra系统及调控目的基因表达。

31、在一种或多种优选实施方式中，所述目的基因为酶基因，所述酶基因包括核苷三磷酸酶(nucleoside triphosphatase)基因(nudi)和/或脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase)基因(dxs)；所述crispra系统用于激活核苷三磷酸酶基因和/或脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因的转录，进而提高酶的表达，促进蓝细菌中的异戊烯醇生物合成。

32、在本发明的另一方面，提供一种基因工程改造的蓝细菌，其中包含所述的调控目的基因表达的蓝细菌crispra系统。

33、在一种或多种优选实施方式中，所述dcas9与转录激活蛋白rpoz的编码基因的表达框替换蓝细菌内源rpoz基因，或插入到蓝细菌染色体的中性位点nsiii；所述sgrna的表达框和目的基因的表达框插入到蓝细菌染色体的中性位点nsii；所述目的基因的表达框插入到蓝细菌染色体的中性位点nsii。

34、在本发明的另一方面，提供一种生物合成异戊烯醇的方法，包括：(a)提供基因工程改造的蓝细菌，其中包含所述的调控目的基因表达的蓝细菌crispra系统；(b)培养(a)的蓝细菌，从而生物合成异戊烯醇。

35、在本发明的另一方面，提供一种用于调控目的基因表达或用于目的基因参与的生物合成的试剂盒，其中含有所述的调控目的基因表达的蓝细菌crispra系统；或所述的基因工程改造的蓝细菌。

36、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。