一种MMP-2酶响应的纳米治疗性材料及其制备方法和应用

本发明涉及一种mmp-2酶响应的纳米治疗性材料及其制备方法，属于纳米复合材料制备和应用。

背景技术：

1、癌症对人类的健康和生命造成的威胁越来越引起科研工作者们的注意，随着科学技术的发展，对于癌症的治疗手段也愈发多样化。近年来基因疗法在治疗恶性肿瘤中取得了巨大的进展，但是对于癌症的治疗效果始终不尽如人意，其中寡核苷酸疗法正在成为基因治疗有前途的平台。目前，寡核苷酸药物主要包括以下几种：反义寡核苷酸、sirna、核酸适配体、脱氧核酶(dnazyme)和cpg寡核苷酸等。其中dnazyme相比于反义寡核苷酸和sirna等传统基因沉默寡核苷酸药物来说，具有强大的酶促转换特性，且不需要形成内源性rna诱导的沉默复合物(rna-induced silencing complex，risc)。但是dnazyme在体内容易降解以及无法特定的导向靶器官进而高效导入癌细胞的问题限制了它的使用，所以寻找合适的载体就尤为重要。

2、作为基因治疗中理想载体之一的病毒衣壳蛋白组装形成的类病毒颗粒(viruslike particles，vlps)，因其具有纳米尺寸、大小均一且对称的结构排列、具备负载能力、易可控自组装、修饰和靶向、高效的导入特定的组织和细胞的特点，使得它们近年来在药物递送领域受到了广泛关注。

3、然而dnazyme以内吞形式进入肿瘤细胞，容易在溶酶体中被降解或者难以逃逸从而无法很好的发挥作用。为了解决这个问题，研究人员会负载光敏剂孟加拉玫瑰红(rosebengal，rb)，在近红外光的照射下，rb会产生活性氧(reactive oxygen species，ros)，破坏溶酶体膜，有利于dnazyme的逃逸从而发挥作用(chen,yaoxuan,rupeng zhao,lele li,and yuliang zhao."upconversion luminescence-boosted escape of dnazyme fromendosomes for enhanced gene-silencing efficacy."angewandte chemie 134,no.34(2022):e202206485)。但是以上手段都很难避免肿瘤的转移和再次复发，因此免疫疗法成为了近几年关注的热点，免疫疗法能够启动病患全身的免疫系统，全面打击癌细胞，从而预防癌症扩散、复发和转移，同时对于癌症晚期的患者，通过该疗法也能获得长期生存。免疫疗法中的免疫检查点阻断无论是在实验还是临床中都取得了显著的进展，使用可以与肿瘤细胞表面程序性死亡因子配体(programmed cell death ligand 1，pd-l1)结合的pd-l1拮抗肽，可以激活t细胞，从而实现抗肿瘤免疫治疗的效果，但是直接递送pd-l1拮抗肽会导致全身免疫毒性。因此靶向递送pd-l1拮抗肽成为了科研工作者们研究的难题。众所周知，肿瘤组织相比较正常组织而言，会过度分泌某些特定的酶，如基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase 2，简写为mmp-2)、组织蛋白酶(cathepsin)、透明质酸酶(haase)等。是否能利用这些酶将pd-l1拮抗肽智能响应释放到肿瘤部位并不清楚，如何将pd-l1拮抗肽靶向递送到肿瘤部位还可只在肿瘤部位释放是需要解决的技术难题。

4、本发明利用肿瘤会过度分泌某些特定的酶这一特性开发了酶响应性肿瘤靶向药物传递系统，将mmp-2酶敏感的小肽序列plglag引入人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)16型类病毒颗粒(virus like particles，vlps)外部并与pd-l1拮抗肽进行连接，既可以将其靶向递送到肿瘤部位，还可以使其只在肿瘤部位释放，很好的解决了pd-l1拮抗肽会导致全身免疫毒性的问题。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、本发明的目的在于提供一种mmp-2酶响应的纳米治疗性材料，该材料可向基质金属蛋白酶响应性肿瘤靶向药物传递系统。

3、(二)技术方案

4、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

5、一种mmp-2酶响应的纳米治疗性材料，其为人乳头瘤病毒16型类病毒颗粒(hpvvlps)蛋白(hpv 16l1)内部包封脱氧核酶-靶向核仁素的核酸适配体偶联物(dnazyme-as1411)和吲哚菁绿(icg)、外部连接mmp-2酶响应小肽和程序性死亡因子配体1(pd-l1)的拮抗肽形成的纳米颗粒，其中，脱氧核酶-寡核苷酸适体偶联物为dnazyme-as1411，as 1411为靶向核仁素的核酸适配体。

6、该纳米颗粒既可以通过荧光对肿瘤部位进行成像又可以起到治疗并消除肿瘤的作用效果。

7、进一步地，优选人乳头瘤病毒16型类病毒颗粒(hpv vlps)蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，脱氧核酶的核苷酸序列为如seq id no.2所示，as1411为靶向核仁素的核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述mmp-2酶响应小肽的氨基酸序列如seqid no.4所示；程序性死亡因子配体1的拮抗肽的氨基酸序列如seq id no.5所示。

8、具体的：seq id no.1：mqvtfiyilvitcyendvnvyhiffqmsl wlpseatvylppvpvskvvstdeyvartniyyhagtsrllavghpyfpikkpnnnkilvpkvsglqyrvfrihlpdpnkfgfpdtsfynpdtqrlvwacvgvevgrgqplgvgisghpllnklddtenasayaanagvdnrecismdykqtqlcligckppigehwgkgspctnvavnpgdcpplelintviqdgdmvdtgfgamdfttlqanksevpldictsickypdyikmvsepygdslffylrreqmfvrhlfnragavgdnvpddlyikgsgstanlassnyfptpsgsmvtsdaqifnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmslcaaistsettykntnfkeylrhgeeydlqfifqlckitltadvmtyihsmnstiledwnfglqpppggtledtyrfvtsqaiacqkhtppapkedplkkytfwevnlkekfsadldqfplgrkfllqaglkakpkftlgkrkatpttsststtakrkkrkl；

9、seq id no.2：5′-cctcggccaggctagctacaacgaccgctcc-3′；

10、seq id no.3：5′-ggtggtggtggttgtggtggtggtgg-3′；

11、seq id no.4：plglag；

12、seq id no.5：cvrartr。

13、如上所述纳米治疗性材料的制备方法，其包括如下步骤：

14、s1、准备人乳头瘤病毒16型类病毒颗粒蛋白hpv 16l1；

15、s2、将脱氧核酶与靶向核仁素的核酸适配体采用点击化学的方式进行连接，具体是将二苯并环辛炔修饰的脱氧核酶与叠氮修饰的靶向核仁素的核酸适配体溶于dpbs溶液中，孵育后得到dnazyme-as1411偶联物；

16、s3、将hpv 16l1、icg和dnazyme-as1411偶联物振荡孵育，然后于组装溶液中进行组装；组装完成后再于pbs纯化溶液中进行纯化，去除游离的icg和dnazyme-as1411偶联物，得到人乳头瘤病毒16型类病毒颗粒(hpv vlps)蛋白内部包封dnazyme-as1411偶联物和吲哚菁绿(icg)的纳米颗粒，记为hpv vlp-dnazyme-as1411-icg；

17、s4、将hpv vlp-dnazyme-as1411-icg纳米颗粒置换溶液，然后将其与-nhs修饰的含程序性死亡因子配体1(pd-l1)的拮抗肽与mmp-2酶响应小肽的多肽振荡孵育，再在pbs纯化溶液中进行纯化去除游离的小肽和置换溶液，最终得到hpv vlps内部包封dnazyme-as1411偶联物和icg、外部通过氨基和nhs连接mmp-2酶响应的小肽和pd-l1拮抗肽的纳米颗粒即纳米治疗性材料，记为hpv vlp-dnazyme-as1411-icg@pp纳米颗粒，其中@表示化学偶联pdl1拮抗剂肽。

18、如上所述的制备方法，优选地，在步骤s1中，人乳头瘤病毒16型类病毒颗粒蛋白hpv 16l1的制备是将带有编码如seq id no.1所示的hpv 16l1蛋白的基因序列的重组质粒导入大肠杆菌中，并诱导其表达蛋白；然后进行离心，将所得沉淀超声破碎后再离心，对所得上清液进行提纯，从而得到蛋白hpv 16l1。

19、进一步优选地，诱导采用终浓度为0.2mm的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-thiogalactoside，iptg)，诱导表达时间为15～20h；超声破碎时所用的超声溶液为含有20mm pb、200mm nacl，ph＝8；

20、提纯采用填料为hitrap sp ff的阳离子交换柱在蛋白纯化仪中进行，收集60％体积的洗脱液条件下得到目的蛋白hpv 16l1。

21、如上所述的制备方法，优选地，在步骤s2中，脱氧核酶的的核苷酸序列为如seq idno.2所示；

22、靶向核仁素的核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.3所示；

23、二苯并环辛炔修饰的脱氧核酶与叠氮修饰的靶向核仁素的核酸适配体按摩尔比为1:1加入，所述dpbs溶液为去离子水溶液，其中含2.67mm kcl、1.47mm kh2po4、8.10mmna2hpo4、138mm nacl，ph＝7.2；

24、孵育条件为25℃条件下孵育30min～1h。

25、如上所述的制备方法，优选地，在步骤s3中，hpv 16l1与dna zyme-as1411偶联物的摩尔比为4～1：2，hpv 16l1-p与icg的质量比为10:1；所述组装溶液为含终浓度为1mnacl、2.67mm kci、8mm na2hpo4、2mm kh2po4，ph＝7.2的去离子水溶液；组装在500da的透析袋中进行；

26、纯化采用300kd的透析袋中；pbs纯化溶液为含终浓度为137mm nacl、8mm na2hpo4、2mm kh2po4、2.7mm kci，ph＝7.2的去离子水溶液。

27、进一步地，hpv 16l1 dnazyme-as1411偶联物的摩尔比优选为1：2；hpv 16l1-p与icg的质量比过高会诱导蛋白沉淀，过低后期治疗没有效果，因此优选hpv 16l1-p与icg的质量比为10:1。

28、如上所述的制备方法，优选地，在步骤s4中，是将hpv vlp-dna zyme-as1411纳米颗粒置于300kd的透析袋中置换溶液，置换溶液中含500mm nacl、2.67mm kci、10mmna2hpo4、2mm kh2po4，ph＝8；

29、-nhs修饰的含程序性死亡因子配体1(pd-l1)的拮抗肽与mmp-2酶响应小肽连接的多肽的序列为seq id no.6：cvrartrplglag-nh s；

30、hpv vlp-dnazyme-as1411纳米颗粒与程序性死亡因子配体1(pd-l1)的拮抗肽与mmp-2酶响应小肽连接的多肽按质量比1:1添加；振荡孵育条件在4℃、振荡孵育3h，振荡速率为100rpm～200rpm；从而将hpv vlp-dnazyme-as1411纳米颗粒与多肽cvrartrplglag-nhs通过氨基和nhs进行化学偶联。

31、dnazyme-as1411偶联物、程序性死亡因子配体1(pd-l1)的拮抗肽与mmp-2酶响应小肽连接的多肽在制备靶向治疗肿瘤药物中的应用。进一步地，dnazyme的核苷酸序列如seq id no.2所示，as1411的核苷酸序列如seq id no.3所示，多肽的氨基酸序列如seq idno.6所示。

32、如上所述的纳米治疗性材料在制备靶向治疗肿瘤药物中的应用。

33、(三)有益效果

34、本发明的有益效果是：

35、本发明制备的mmp-2酶响应的纳米治疗性材料，相比较现有技术相比的有益效果如下：

36、1、本发明所采用的药物载体以及药物本身都是极其安全的，对人体几乎没有毒性，具有良好的生物相容性。

37、2、本发明所制备提供的mmp-2酶响应的纳米治疗性材料的制备方法，获得纳米颗粒易量产，稳定性高，制备方法简单，药物生物利用度高。

38、3、本发明所制备的mmp-2酶响应的纳米治疗性材料为纳米颗粒，大小约为70nm，可以靶向肿瘤细胞，以及因其纳米尺寸有利于更好的进入肿瘤细胞，从而将药物精准的递送到肿瘤部位并释放。

39、4、本发明的制备方法中，采用点击化学的方式将dnazyme与as1411进行偶联，直接将dnazyme递送到细胞核，可以更高效的下调目的蛋白的表达。

40、5、本发明提供的mmp-2酶响应的纳米治疗性材料中，无论是载体hpv vlps的靶向性还是mmp-2酶的响应都可以很好的解决免疫疗法所带来的全身免疫毒性。

41、6、本发明提供的mmp-2酶响应的纳米治疗性材料，所采用的hpv vlps包封icg可以很好的改善icg容易荧光猝灭，不稳定的缺点；既可以实现对肿瘤的成像也可以实现对肿瘤的治疗，从而可以达到诊疗一体化的作用。