一种脐带源干细胞外泌体皮肤修复剂及其制备工艺的制作方法

本发明涉及生物技术相关领域，具体涉及一种脐带源干细胞外泌体皮肤修复剂及其制备工艺。

背景技术：

1、皮肤作为人体与外界直接接触的器官，最容易受伤，皮肤在损伤后需要漫长的一段时间进行自愈，为了加快皮肤修复的时间，避免疤痕的产生，常需要借助一些修复剂辅助修复。干细胞疗法在再生医学领域表现出巨大潜力，尤其是脐带间充质干细胞，由于其来源广泛，提取方便，低免疫原性等优势受到了越来越多人的关注。经研究发现，间充质干细胞旁分泌的直径为100nm左右的囊泡结构-外泌体，因带有源细胞的细胞因子、生长因子、mrna、脂质和蛋白质，对皮肤损伤方面具有明显促修复的药用作用。

2、目前，在使用脐带源干细胞外泌体药物修复皮肤时，还会通过壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶材料负载外泌体，减缓外泌体在创伤部位的释放速度，延长外泌体释放时间，以促进皮肤创面修复，缩短伤口愈合时间及减少瘢痕形成。然而，在负载递送药物过程中，壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶骨架本身也处于快速溶蚀、降解的过程，导致药物通过凝胶孔洞扩散出来，因此缓释效果不佳。

3、此外，皮肤损伤时容易受细菌感染，导致皮肤伤口溃脓、发炎，虽然壳聚糖具有一定的抗菌、抗炎效果，但由于壳聚糖是一种天然高分子，在储存和运输过程中容易受到温度、湿度等环境因素的影响，导致其稳定性较差，抗菌抗炎效果不佳。

4、因此，提出一种能够增强缓释功能和抗菌抗炎功能的脐带源干细胞外泌体皮肤修复剂及其制备工艺。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种脐带源干细胞外泌体皮肤修复剂的制备工艺。

2、一种脐带源干细胞外泌体皮肤修复剂的制备工艺，包括有如下步骤：

3、s1：脐带间充质干细胞的原代提取和培养

4、取新鲜脐带，在无菌条件下，将新鲜脐带剪成小段，得到脐带段，用磷酸盐缓冲液反复冲洗脐带段3～4次，将脐带段消化、分离，得到脐带间充质原代干细胞，利用培养基对脐带间充质原代干细胞进行传达培养，并收集传达培养过程中的上清液，对收集到的上清液先进行初步离心去除死细胞和细胞碎片，再进行超速离心去除微粒杂质，得到脐带源干细胞外泌体；

5、s2：制备儿茶酚衍生物修饰的壳聚糖

6、将壳聚糖溶于磷酸盐缓冲液中，加入氢化肉桂酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺进行接枝反应，透析并冷冻真空干燥得到儿茶酚衍生物修饰的壳聚糖；

7、s3：制备氧化葡聚糖

8、将葡聚糖溶于水中，加入高碘酸钠溶液后搅拌，通过化学沉淀法进行除杂，透析并冷冻真空干燥得到氧化葡聚糖；

9、s4：制备黑磷纳米片

10、将黑磷粉末和n-甲基吡咯烷酮混合，然后超声剥离黑磷粉末，再高速离心除去水相，得到黑磷纳米片沉淀，之后清洗黑磷纳米片沉淀得到黑磷纳米片；

11、s5：制备多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物

12、先将羧基化多壁碳纳米管、亚硫酰氯和n，n-二甲基甲酰胺三者进行混合搅拌，然后进行回流得到酰氯化产物，再对酰氯化产物进行抽滤、洗涤，之后加入三乙胺，搅拌混合后，水洗除杂，再冷冻真空干燥，得到多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物；

13、s6：制备黑磷纳米片复合温敏凝胶

14、将儿茶酚衍生物修饰的壳聚糖溶于磷酸盐缓冲液中，加入多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物，超声处理得到壳聚糖混合溶液，另取β-甘油磷酸钠溶于去离子水中，得到β-甘油磷酸钠溶液，将β-甘油磷酸钠溶液逐滴加入到壳聚糖混合溶液中，反应得到含氨基化碳纳米管的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏剂，另取氧化葡聚糖溶于磷酸盐缓冲液中，得到氧化葡聚糖溶液，另取黑磷纳米片溶于磷酸盐缓冲液中，得到黑磷纳米片溶液，将黑磷纳米片溶液与氧化葡聚糖溶液直接混合后，加入含氨基化碳纳米管的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏剂，搅拌混合得到黑磷纳米片复合温敏凝胶；

15、s7：黑磷纳米片复合温敏凝胶负载外泌体得到皮肤修复剂

16、将脐带源干细胞外泌体和黑磷纳米片复合温敏凝胶混合搅拌，得到负载脐带源干细胞外泌体的黑磷纳米片复合温敏凝胶，置于3～5℃保存，得到皮肤修复剂。

17、进一步地，步骤s2制备儿茶酚衍生物修饰的壳聚糖包括以下步骤：

18、s2.1：称量2～4质量份壳聚糖，溶于1～2体积份磷酸盐缓冲液，得到壳聚糖溶液；

19、s2.2：称量1～2质量份氢化肉桂酸，将所称的氢化肉桂酸加入壳聚糖溶液，得到混合反应液；

20、s2.3：在26～40℃的环境下，在混合反应液中加入壳聚糖氨基摩尔数1.5～2倍的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺作为活化剂，并在混合反应液中加入与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺同等用量的n-羟基琥珀酰亚胺作为辅助活化剂，使得壳聚糖中的氨基与氢化肉桂酸中的羧基发生接枝反应，反应12～24h后，得到接枝生成物；

21、s2.4：将接枝生成物置于透析袋中，于蒸馏水中透析24～36h，去除未反应的试剂和副产物，将透析处理后的接枝生成物放在温度为-10℃～-5℃的环境中冷冻干燥2～3h，得到儿茶酚衍生物修饰的壳聚糖。

22、进一步地，步骤s3制备氧化葡聚糖包括以下步骤：

23、s3.1：称取1～3质量份葡聚糖，溶于55～65体积份水中，加入5～15体积份高碘酸钠溶液，于避光室温条件下搅拌反应23～24h，得到溶液a；

24、s3.2：在溶液a中加入醋酸钡溶液，直至产生白色沉淀1～2min后，停止加入醋酸钡溶液，并过滤除去沉淀，得到溶液b；

25、s3.3：在溶液b中加入硫酸钠溶液，直至产生白色沉淀1～2min后，停止加入硫酸钠溶液，并过滤除去沉淀，得到溶液c；

26、s3.4：将溶液c置于透析袋中，于蒸馏水中透析24～36h，得到溶液c的透析处理液，将溶液c的透析处理液置于温度为-10℃～-5℃的环境中冷冻干燥2～3h，得到氧化葡聚糖。

27、进一步地，步骤s4制备黑磷纳米片包括以下步骤：

28、s4.1：将45～55质量份99％～100％纯度的黑磷粉末加入含有45～55体积份n-甲基吡咯烷酮的高速离心管中，在功率为420～450w，频率为22～27khz的条件下，用细胞破壁机超声研磨探头剥离黑磷粉末5～8h，得到黑磷纳米片分散液；

29、s4.2：将得到的黑磷纳米片分散液以7200～7800rpm的转速离心15～30min，分离除去水相得到黑磷纳米片沉淀；

30、s4.3：将黑磷纳米片沉淀倒出高速离心管，并用去离子水对黑磷纳米片沉淀清洗2～3次，得到黑磷纳米片。

31、进一步地，整个步骤s4的制备过程在3～4℃环境下进行。

32、进一步地，步骤s5制备多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物包括以下步骤：

33、s5.1：取99～101质量份羧基化多壁碳纳米管，15～25体积份亚硫酰氯和0.5～1.5体积份n，n-二甲基甲酰胺，三者进行混合搅拌，得到混合物a，在35～45℃环境下，使用回流冷凝管对混合物a回流18～36h，得到酰氯化产物；

34、s5.2：用抽滤瓶对酰氯化产物进行抽滤，除去液相，再用n，n-二甲基甲酰胺重复洗涤3～5次，得到净化处理的酰氯化产物；

35、s5.3：取3～5体积份n，n-二甲基甲酰胺溶液，加入90～95质量份聚乙烯亚胺进行溶解，再加入净化处理的酰氯化产物，高速搅拌1～2h，得到混合物b；

36、s5.4：向混合物b中加入18～25体积份的三乙胺，在45～50℃环境下进行磁力搅拌，反应48～72h，得到混合物c，然后用蒸馏水对混合物c透析60～72h，去除杂质，冷冻干燥48～72h，得到多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物。

37、进一步地，步骤s6制备黑磷纳米片复合温敏凝胶包括以下步骤：

38、s6.1：将15～25质量份儿茶酚衍生物修饰的壳聚糖溶于0.5～1.5体积份ph＝7～8的磷酸盐缓冲液中，得到儿茶酚衍生物修饰的壳聚糖溶液，在儿茶酚衍生物修饰的壳聚糖溶液中加入15～25质量份多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物，超声1.5～2h分散均匀，得到壳聚糖混合溶液，另取15～25质量份的β-甘油磷酸钠，溶于0.5～1.5体积份去离子水中，得到β-甘油磷酸钠溶液，将β-甘油磷酸钠溶液逐滴加入到壳聚糖混合溶液中，反应得到含氨基化碳纳米管的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏剂；

39、s6.2：将35～45质量份氧化葡聚糖溶于0.5～1.5体积份ph＝7～8的磷酸盐缓冲液中，得到氧化葡聚糖溶液，将0.2～0.8质量分黑磷纳米片溶于0.5～1.5体积份ph＝7～8的磷酸盐缓冲液中，得到黑磷纳米片溶液；

40、s6.3：将黑磷纳米片溶液与氧化葡聚糖溶液直接按体积比1:1混合，得到溶液d，再按氧化葡聚糖溶液两倍的体积量向溶液d中加入含氨基化碳纳米管的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏剂，在26～40℃的温度下，搅拌混合15～20min，得到黑磷纳米片复合温敏凝胶。

41、进一步地，步骤s7黑磷纳米片复合温敏凝胶负载外泌体得到皮肤修复剂包括以下步骤：

42、将脐带源干细胞外泌体和黑磷纳米片复合温敏凝胶以1:3比例混合并搅拌0.5～1h，使得黑磷纳米片复合温敏凝胶负载脐带源干细胞外泌体，得到皮肤修复剂，将皮肤修复剂置于3～5℃保存待用。

43、进一步地，步骤s3.1中高碘酸钠溶液的浓度为0.1～0.2g/ml。

44、一种脐带源干细胞外泌体皮肤修复剂，其由上述脐带源干细胞外泌体皮肤修复剂制备工艺的制备得到。

45、本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：

46、1、在氧化葡聚糖溶液中加入黑磷纳米片后，凝胶的三维支架结构可形成物理阻隔层，延缓溶剂分子到达凝胶骨架本身，从而抑制凝胶腐蚀，且在儿茶酚衍生物修饰的壳聚糖溶液中加入多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物后，凝胶强度增大，结构致密，孔洞变小，最终导致凝胶溶蚀速率的进一步减慢，不仅可以快速凝胶化，而且还明显减小凝胶孔径，使其结构更加致密，从而带来骨架材料降解过程的变化，进一步减缓药物扩散释放，增强了缓释效果。

47、2、通过将黑磷纳米片溶液、氧化葡聚糖溶液和含氨基化碳纳米管的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏剂复合制备得到黑磷纳米片复合温敏凝胶后，在黑磷纳米片的光热效应以及壳聚糖中存在的丰富氨基基团的协同作用下，加快了细菌细胞膜的裂解，进一步增强了凝胶的抗菌作用，使得制备得到的皮肤修复剂能够用于皮肤抗菌的治疗，以加快感染性烧伤创面的愈合。

48、3、通过将黑磷纳米片溶液、氧化葡聚糖溶液和含氨基化碳纳米管的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏剂复合制备得到黑磷纳米片复合温敏凝胶后，壳聚糖和葡聚糖协同作用，使得凝胶为皮肤再生过程中的再上皮化提供了适宜的免疫微环境，能够有效促进皮下血管的再生，缓解损伤早期的炎症反应，进一步增强了凝胶的抗炎作用，使得制备得到的皮肤修复剂能够对感染烧伤创面的炎症进行有效控制。