葡萄球菌属在肿瘤转移中的作用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及葡萄球菌属细菌抑制剂在肺癌治疗的应用。

背景技术：

1、非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer, nsclc)约占肺癌死亡的80%，其中肺腺癌 (lung adenocarcinoma, luad)是nsclc中最常见的病理类型。绝大部分肺腺癌患者一经诊断即为晚期转移阶段，这也是导致其死亡的主要原因[1-3]。因此阐明导致肺腺癌转移的潜在机制十分必要。

2、目前已经有大量研究试图从细胞层面剖析肺腺癌转移的潜在原因（表观遗传学、转录组学、基因组学），但细胞外部的肿瘤微环境组分所发挥的作用却鲜有报道。2022年初，肿瘤多态微生物组(polymorphic microbiomes)被添加为新的“肿瘤标志性特征” (cancerhallmark)之一[4]，可见多态微生物群作为肿瘤生长过程中的重要一环已为广泛学者所接受。这些 “瘤内微生物群”可以通过调节代谢、免疫等途径影响肿瘤细胞的生物学行为[5,6]。许多功能实验表明，菌群失调(dysbiotic microbiome)与多种肿瘤进展相关，如结肠癌、胰腺癌、乳腺癌等[7-10]，而肺癌中则少有报道。肺是人体最大的粘膜组织器官，在很长一段时间内被认为是无菌的。近年来，随着非培养组学测序技术的发展，如16s rrna测序、宏基因组测序等，颠覆了我们对下呼吸道微生物群落结构的认识。我们发现，肺组织实际上也有多种微生物群落定植，但与肠道菌群不同，肺部定植菌丰度较低[11,12],因此并没有引起学者们的广泛关注。然而，研究表明，相较于肠道菌群，肺部肿瘤微环境中的共生微生物可直接作用于肿瘤细胞，其对肺癌细胞生物学行为的影响更为显著。因此，探索肺腺癌进展过程中潜在的微生物的作用，可能有助于新的生物标志物及全新治疗策略的研发，从而改善肺腺癌患者的远期预后。

3、研究表明，基于唾液、痰、支气管镜肺泡灌洗液以及肺癌组织标本的测序结果，肺癌组织表现出了与正常组织截然不同的微生物特征谱，其中一些物种甚至会影响患者的无病生存期 (disease free survival, dfs) [13]。例如，相较于正常组织，葡萄球菌属( staphylococcus)、链球菌属 ( streptococcus)以及韦永氏球菌属( veillonella)在肺癌组织中的丰度更高[14]。此外也有学者发现，结核分枝杆菌与肺癌的发生发展密切相关。同时小鼠模型中也呈现出相关的证据：(1)与spf小鼠相比，tp53/kras双突变无法在无菌鼠以及接受抗生素处理的小鼠模型中诱导肺癌形成[15]； (2)肺部共生菌群能够诱导局部免疫抑制微环境的形成（招募中性粒细胞及γt 细胞）从而辅助转移瘤细胞的肺内定植，而雾化吸入抗生素可以显著减少小鼠模型的肺部转移灶数量[16]。这些研究结果证实了肺部共生菌群在肺癌发展过程中的促进作用，然而，目前研究大部分停留在通过测序技术解析肺部微生物的生态结构失衡及其与患者临床病理参数的关联分析等宏观特征层面，无法回答以下两个关键问题，即：肺部菌群稳态的变化与肺癌发生发展之间是否存在因果关系，以及特定微生物能否作为肺癌治疗的潜在靶点。因此深入到特定菌株及其致癌机制等微观层面就显得至关重要。

4、基于此，本研究结合了微生物培养组学技术、多组学生信分析手段以及肿瘤来源类器官模型的功能实验，旨在探索瘤内定植微生物对肺腺癌转移的影响。

技术实现思路

1、申请人首先通过大样本临床队列分析，发现围手术期感染显著缩短肺腺癌患者的无病生存期，提示了微生物在促进肿瘤进展过程中的重要作用。申请人进一步通过整合16srrna测序以及微生物培养组学技术聚焦到葡萄球菌属很可能作为肺腺癌组织中的优势菌群在转移过程中扮演重要角色。同时，基于肺癌类器官模型和动物模型的功能实验探索进一步发现：葡萄球菌感染能够在肿瘤微环境中产生大量乳酸并激活肿瘤细胞的乳酸转运蛋白(mct-1等)，增强乳酸摄取能力并提升胞内总蛋白的乳酸化水平，最终促进上皮间质转化过程的发生以及肿瘤细胞侵袭力的增强，且该作用能够被mct-1抑制剂azd3965所阻断，该结果提示了细菌源性乳酸在肿瘤转移过程中所发挥的重要作用，为基于扼制瘤内微生物作用网络的肺癌治疗策略研发提供了新的线索。

2、葡萄球菌属在肿瘤中的作用已初现端倪

3、本发明发现，葡萄球菌感染能够引发肺癌细胞转移能力的增强，其中，以尼泊尔葡萄球菌（ staphylococcus nepalensis，s.nepalensis）和头状葡萄球菌（ staphylococcus  capitis，s.capitis）尤为显著 (参见实施例2)。在现有技术中对于细菌与肿瘤之间相互作用的研究通常直接使用购买或保藏的菌株在体外研究其与肿瘤之间的关系；虽然葡萄球菌例如尼泊尔葡萄球菌（ staphylococcus nepalensis，s.nepalensis）和头状葡萄球菌（ staphylococcus capitis，s.capitis）是现有技术中已知的菌株，但本发明首次发现葡萄球菌特别是尼泊尔葡萄球菌（ staphylococcus nepalensis，s.nepalensis）和头状葡萄球菌（ staphylococcus capitis，s.capitis）存活于肺癌组织中，并通过培养组学手段将其从肺癌组织中分离、培养并用于后续研究与癌症转移之间的密切关联，将患者源性菌株作为研究对象是本发明重要创新点之一。

4、葡萄球菌属( staphylococcus)是革兰氏阳性菌的代表，因在显微镜下呈球形类似葡萄而得名；是一种常见的引发医院内交叉感染的机会性致病菌 (opportunisticpathogen)。

5、与此同时，多数葡萄球菌属的细菌能够分解葡萄糖并产生有机酸类物质，如乳酸、醋酸、丙酸等[19]。我们发现葡萄球菌感染能够在微环境中产生大量乳酸并营造酸性的肿瘤微环境。正常组织或血液的ph值为7.4，而适合肿瘤细胞生存的微环境ph则为5.6-7.0[20]。长久以来，乳酸一直被视为细胞无氧糖酵解途径的代谢废物，然而最新研究显示，乳酸作为肿瘤微环境中的信号分子能够通过多种途径重塑肿瘤细胞的生物学行为，比如直接抑制phd2以提升hif-1α转录因子活性、诱导活性氧产生(ros)、激活nf-κb信号通路以及促进vegfr的表达，促进血管生成等。然而，乳酸作为一种代谢产物，在人体其他生理病理过程中所发挥的非代谢相关的作用仍然是未知的。我们发现，乳酸水平的上调能够激活mct1，增加乳酸的摄取，进而促进肺腺癌的转移，且该作用能够被 mct1 抑制剂 azd3965 所阻断。

6、综上所述，本发明整合多组学分析策略进一步探明相关分子机制，为临床诊疗实践中对特定肿瘤微生物进行有效干预的必要性提供实验证据支持，以期延缓转移的发生并为癌症例如肺腺癌患者的治疗提供新的思路。

7、在本发明的具体实施方案中，所述乳酸转运蛋白又称为单羧酸转运蛋白（monocarboxylate transporters，mcts），其为溶质运载蛋白16（solute carrier 16，slc16）家族的一部分，由具有细胞内n-端及c-端的12个跨膜螺旋结构和第6及第7螺旋结构之间的大胞质环组成，其包含14个成员，其中mct1-4表现出质子耦连的单羧酸类物质的转运，包括丙酮酸、乳酸、酮体以及短链脂肪酸（丙酸和丁酸）。

8、mct的主要功能是介导质子耦连的乳酸等单羧酸类物质的跨膜转运，mct的异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。例如，mct介导乳酸转运还能促进肿瘤血管生成以及诱导肿瘤免疫耐受。

9、在本发明中，仅示例性地验证了葡萄球菌属在肺癌例如肺腺癌中的促转移作用，实际上，基于现有泛癌种研究结果，葡萄球菌广泛的存在于多种人类肿瘤组织中（pmid:36565918, pmid: 37140927），本领域技术人员可以预期葡萄球菌例如尼泊尔葡萄球菌( s.  nepalensis)或头状葡萄球菌( s.capitis)在其他肿瘤中同样具有促转移的效果。

10、具体地，本发明提供了以下技术方案：

11、1. 乳酸转运蛋白抑制剂或抑制葡萄球菌中乳酸产生的核酸分子在制备用于治疗具有葡萄球菌感染的肿瘤的药物或试剂盒中的用途。

12、2. 根据项目1所述的用途，其中，所述抑制葡萄球菌中乳酸产生的核酸分子的序列如seq id no: 1-2, 7-8所示。

13、3. 根据项目1所述的用途，其中，所述葡萄球菌是尼泊尔葡萄球菌( s.  nepalensis)或头状葡萄球菌( s.capitis)。

14、4. 根据项目1所述的用途，其中，所述乳酸转运蛋白是mct-1；

15、5. 根据项目1或4所述的用途，其中，所述乳酸转运蛋白抑制剂包括靶向乳酸转运蛋白的小分子化合物或抗体；

16、在本发明的具体实施方案中，所述乳酸转运蛋白抑制剂包括但不限于azd3965 和ar-c155858，4，4′-二异硫氰基芪-2，2′-二磺酸（4，4′-diisothiocyanatostilbene- 2，2′disulfonicacid，dids）。

17、6. 根据项目1所述的用途，其中，所述肿瘤为实体瘤，包括但不限于肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、黑色素肿瘤、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、纤维肉瘤、膀胱肉瘤或神经胶质瘤等。

18、在本发明的具体实施方案中，所述肺癌为肺腺癌或肺鳞癌。

19、7. 抑制具有葡萄球菌感染的肿瘤细胞转移的方法，其包括敲除葡萄球菌中的乳酸产生基因 ldh和 ddh或者向所述肿瘤细胞施用乳酸转运蛋白抑制剂，其中所述方法用于非治疗目的。

20、8. 根据项目7所述的方法，其中所述葡萄球菌是尼泊尔葡萄球菌( s.  nepalensis)或头状葡萄球菌( s.capitis)。

21、9. 根据项目7所述的方法，其中所述乳酸产生基因 ldh和 ddh是通过crisper/cas9技术敲除的。

22、10. 根据项目9所述的方法，其中，所述crisper/cas9中所使用的引物分别如seqid no: 1-2, 7-8所示。