文蛤α-葡萄糖苷酶抑制肽及其筛选方法和应用

本发明属于活性肽领域，具体涉及文蛤α-葡萄糖苷酶抑制肽及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、α-葡萄糖苷酶抑制剂是调控血糖最有效的一种，而通过补充外源性α-葡萄糖苷酶抑制剂，如α-葡萄糖苷酶抑制肽，抑制碳水化合物的分解，改善餐后高血糖状态，成为近年来糖尿病及其并发症干预研究的热点。

2、文蛤（ meretrix meretrix linnaeus），又称蛤蜊，具有很高的食疗和药用价值。目前尚没有针对文蛤模拟消化产物中的α-葡萄糖苷酶抑制肽展开研究。

3、基于生物信息学工具和分子对接虚拟筛选活性肽，是基于活性肽中已知的氨基酸序列，利用数据库搜索和软件分析，对肽段可能的生物活性、安全性及构效关系等进行模拟预测，得到目标肽段。通过进一步评估配体与受体间的相互作用，快速靶向筛选目标活性肽的方法。与传统制备方法相比，通过生物信息学工具及分子对接虚拟筛选能节省大量的时间成本和实验成本。实际操作中，将这两种方案结合使用，可以大大提高筛选的有效性以及结果的准确性。采用这种手段在文蛤中筛选出天然α-葡萄糖苷酶抑制肽，对于辅助降糖类活性成分在功能性产品中的应用具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种文蛤α-葡萄糖苷酶抑制肽。

2、本发明的目的之二在于提供上述文蛤α-葡萄糖苷酶抑制肽的筛选方法。

3、本发明的目的之三在于提供上述文蛤α-葡萄糖苷酶抑制肽的应用。

4、为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：

5、本发明在文蛤中筛选到了6条活性较高的α-葡萄糖苷酶抑制肽，所述α-葡萄糖苷酶抑制肽序列分别为fagddapr（phe-ala-gly-asp-asp-ala-pro-arg，如seq id no.1所示）、vplf（val-pro-leu-phe，如seq id no.2所示）、yrrl（tyr-arg-arg-leu，如seq idno.3所示）、wdh（trp-asp- his）、ppla（pro-pro-leu-ala，如seq id no.4所示）、wsg（trp-ser-gly）。

6、上述α-葡萄糖苷酶抑制肽的筛选方法，所述方法包括如下步骤：

7、（1）文蛤肉匀浆液的制备：取一定量文蛤洗净擦干，水开后隔水蒸15 min，至文蛤壳全部打开，冷却至室温，将软体组织与汁液全部取出，于高速组织捣碎机匀浆3次，每次30s，获得匀浆液；

8、（2）infogest 体外静态模拟消化模型：首先，按体积比1：1的比例加入模拟唾液，在37 ℃ 100 rpm恒温振荡器里消化2 min，模拟口腔消化；然后，利用6 mol/l的盐酸溶液调节ph至3.0，终止口腔消化过程，按体积比1：1的比例加入模拟胃液，混合均匀，恒温振荡消化2 h，模拟胃消化，实验过程中，以1 mol/l 盐酸溶液控制消化液ph在3.0；最后，利用5mol/l氢氧化钠溶液调节ph至6.0，终止胃消化过程，按体积比1：1的比例加入模拟肠液，混合均匀，再利用1 mol/l碳酸氢钠溶液调节ph至7.0，恒温振荡消化2 h，模拟肠消化；

9、（3）文蛤蛋白肽序列鉴定：通过赛默飞easy-nlc1200 q exactive液质联用系统对文蛤蛋白模拟消化产物进行肽谱鉴定；

10、（4）生物信息学工具辅助文蛤α-葡萄糖苷酶抑制肽的筛选：通过biopep数据库对肽的新颖性进行查询，通过peptide ranker工具进行肽的生物活性进行预测，通过biodadpep工具对肽的降血糖生物活性进行预测，通过peptide cutter工具和cpp pred工具对肽的耐消化特性和细胞膜穿透性进行预测，通过pliepred工具对肽在血液中的稳定性进行评估，通过aller topv. 2.0工具对肽的潜在过敏性进行预测，通过toxin pred工具对肽的潜在毒性和理化性质进行预测；

11、（5）分子对接：将筛选出来的α-葡萄糖苷酶抑制肽作为配体，α-葡萄糖苷酶作为受体，通过分子对接技术分析α-葡萄糖苷酶抑制肽与α-葡萄糖苷酶的作用位点和相互作用力；

12、（6）α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定：将一定浓度的多肽溶液与α-葡萄糖苷酶溶液加入酶标板中，混合、温育，然后加入pnpg(对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷)溶液进行反应，无色 pnpg经 α-葡萄糖苷酶水解后释放硝基苯酚（pnp），pnp在碱性条件下是黄色，通过测得 405nm 下 pnp 产生量以计算酶活性的变化，筛选出具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的肽。

13、优选的，步骤（1）的操作，匀浆后需要将匀浆液置于实验冷柜中或立即进行后续实验，避免长期放在室温下导致蛋白及多肽类组分降解。

14、优选的，步骤（2）的操作，每个阶段模拟消化完成后，如不需进行下阶段模拟消化，那么需要将模拟消化液立即置于冰浴中，终止本阶段消化反应。

15、优选的，步骤（3）的操作，利用nano-hplc液相系统easy-nlc 1200 ( thermofisher scientific)分离后用q- exactive质谱仪( thermo fisher scientific)对上述步骤(2)中获得的组分进行质谱分析；获得的质谱数据使用软件maxquant进行分析，并将所得多肽序列与uniprot- acipenser数据库进行对比获取肽序列的蛋白来源。

16、优选的，步骤（4）的操作，peptide ranker评分>0.5或通过biodadpep预测有降血糖活性，过敏性及毒性均不存在作为基本筛选条件。

17、优选的，步骤（5）的操作，分子对接的结果以结合能值表示，与α-葡萄糖苷酶对接结合能低于-8.0 kcal/mol作为进一步的筛选条件。

18、本发明的α-葡萄糖苷酶抑制肽，可通过固相合成方法合成和生产，包括但不限于fmoc-spps方式、boc-spps方式、片段缩合连接方式，可以利用一切可以合成的方法进行，从而更高效的获得文蛤源α-葡萄糖苷酶抑制肽，为所筛选出来的多肽的进一步利用提供材料。

19、本发明的α-葡萄糖苷酶抑制肽可以用在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂、药物或者食品等功能性产品中，所述的药物是以有效量的文蛤α-葡萄糖苷酶抑制肽为活性成分，加上医学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

20、本发明的优点：

21、本发明公开了一种文蛤来源α-葡萄糖苷酶抑制肽及其快速筛选方法和应用，本发明所述的文蛤α-葡萄糖苷酶抑制肽主要经历模拟消化、lc-ms/ms质谱鉴定、生物信息学工具分析预测、分子对接、多肽合成及活性验证筛选得到。通过肽谱鉴定共得到127条序列，其中有12条活性序列已报到，其余115条未报道序列中有39条peptide ranker评分超过0.5，根据peptideranker评分、降血糖活性预测、稳定性、耐消化特性和细胞膜穿透性综合筛选出16条肽序列进行分子对接，结合能低于-8.0 kcal/mol的肽序列有11条。综合考虑潜在活性、安全性及生物可及性后筛选6条序列进行合成及活性验证。经过α-葡萄糖苷酶活性抑制实验证明，多肽fagddapr、vplf、yrrl、wdh、ppla、wsg均具有一定程度的α-葡萄糖苷酶抑制活性，半抑制剂量（ic50值）分别为1.06、2.74、4.80、3.45、2.19、2.97 μmol/l，其中fagddapr的ic50值最低，且明显低于阳性对照阿卡波糖（ic50值2.15 μmol/l）。上述肽段均可作为辅助降糖类活性成分添加至食品、特医食品和药品等功能性产品中。