一种成分明确的间充质干细胞培养基及其应用的制作方法

本发明涉及间充质干细胞培养，具体涉及一种成分明确的间充质干细胞培养基及其应用。

背景技术：

1、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)是一类具有自我更新能力、多向分化潜能和免疫调节功能的多能干细胞。人体内几乎所有的组织中都含有间充质干细胞，多种结缔组织和器官间隙中间充质干细胞含量丰富，如骨髓、牙髓、脂肪及围产期胎盘、脐带和脐血等。间充质干细胞可分泌多种生物活性物质，具有免疫调节、损伤修复、抗细胞凋亡、抗纤维化、抗氧化等多方面的作用。间充质干细胞在多种疾病治疗中表现出很好的效果，尤其是组织损伤性疾病、退行性疾病和自身免疫学疾病等，因此间充质干细胞具有巨大的应用潜力。

2、间充质干细胞培养基作为维持间充质干细胞体外增殖的基础，对于间充质干细胞后续应用的安全和稳定至关重要。目前早期临床试验和科研中，培养间充质干细胞多采用添加胎牛血清的传统培养方式来促进其增殖，这类含有异源血清的培养基具有多项缺点，例如成分不确定，含有异源蛋白和批次间的质量不稳定性等，同时还有异源性污染及细胞内血清残留引发的免疫等问题，很大程度上限制了间充质细胞的应用。近年来，人源的血小板裂解物开始作为一种血清替代物用于培养间充质干细胞，也确实解决了一些异源血清用于培养间充质干细胞时存在的问题，然而成分不明确与批次间稳定性的问题却依然存在。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种成分明确的间充质干细胞培养基，以解决现有技术中使用异源血清用于培养间充质干细胞时的异源性污染、细胞内血清残留引发的免疫反应以及细胞批次稳定性差的技术问题。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种成分明确的间充质干细胞培养基，其包括基础培养基和添加组分；添加组分包括丝胶蛋白、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、地塞米松、n-乙酰-l-半胱氨酸、胰岛素样生长因子ⅰ、转化生长因子-β、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、白蛋白、转铁蛋白和人胰岛素。

4、进一步，基础培养基和添加组分的体积比为25：1。

5、进一步，丝胶蛋白、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、地塞米松、n-乙酰-l-半胱氨酸、胰岛素样生长因子ⅰ、转化生长因子-β、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、白蛋白、转铁蛋白和人胰岛素在添加组分中的含量分别为：5-25μg/ml、0.3-0.6μg/ml、0.2-0.3μg/ml、0.05-0.1μg/ml、15-25mg/ml、1-5μg/ml、1-2ng/ml、1-2ng/ml、0.1-1μg/ml、50-70mg/ml、0.5-1mg/ml、0.1-0.3mg/ml。

6、进一步，丝胶蛋白、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、地塞米松、n-乙酰-l-半胱氨酸、胰岛素样生长因子ⅰ、转化生长因子-β、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、白蛋白、转铁蛋白和人胰岛素在添加组分中的含量分别为：10-20μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.075μg/ml、20mg/ml、3μg/ml、1.5ng/ml、1.5ng/ml、0.5μg/ml、60mg/ml、0.75mg/ml、0.2mg/ml。

7、进一步，所述基础培养基为dmem/f12培养基。

8、进一步，所述dmem/f12培养基的成分组成如下表所示：

9、

10、

11、所述基础培养基和所述添加组分的体积比为25：1。

12、本技术方案还提供了一种成分明确的间充质干细胞培养基在提升或者维持间充质干细胞的增殖效率和/或分化潜能中的应用。

13、本技术方案还提供了一种成分明确的间充质干细胞培养基在提升间充质干细胞的抗逆性能中的应用。

14、本技术方案还提供了一种成分明确的间充质干细胞培养基在维持多次传代后的间充质干细胞的增殖效率、细胞存活率以及阳性细胞表面标志物阳性率≥95％中的应用。传代次数为5-15代，优选10-15代。

15、本技术方案还提供了一种成分明确的间充质干细胞培养基在维持间充质干细胞的间充质干细胞的阳性细胞表面标志物＞99％、阴性细胞表面标志物＜1％中的应用。

16、本发明的原理以及有益效果：

17、针对上述问题，本发明公开了一种成分明确的间充质干细胞无血清培养基，并可用于培养脐带间充质细胞和脂肪间充质干细胞等间充质干细胞。本发明提供的间充质干细胞无血清培养基，3代次培养间充质干细胞后，大量扩增细胞的同时，能够高效的维持其生物学特性和分化潜能。

18、本发明通过在基础培养基中添加rhegf、rhbfgf、地塞米松、n-乙酰-l-半胱氨酸、rhigf-1、rhtgf-β、rhvegf、rhpdgf、重组人血清白蛋白、重组人转铁蛋白和重组人胰岛素等多种营养因子替代血清功能，成分稳定、明确，排除了血清不稳定性。也避免了血小板裂解物等体系用于间充质干细胞培养时的乙肝表面抗原(hbsag)抗体、丙肝病毒(hcv)及艾滋病(hiv-1/2)等质控检测。同时各因子间协同作用可有效促进间充质干细胞的体外扩增效率，提高其扩增倍速，同时细胞一致性好，能够高效的维持其生物学特性和分化潜能，能够向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化。

19、现有技术中报道了丝胶蛋白可以作为细胞培养基的添加物，并且提升细胞的活性(cao ting-ting,zhang yu-qing,the potential of silk sericin protein as a serumsubstitute or an additive in cell culture and cryopreservation.[j].aminoacids,2017,49:1029-1039.；zhang meng,cao ting-ting,wei zheng-guo et al.silksericin hydrolysate is a potential candidate as a serum-substitute in theculture of chinese hamster ovary and henrietta lacks cells.[j].j insect sci,2019,19；pornanong aramwit，the effect of sericin from various extractionmethods on cell viability and collagen production.[j].int j mol sci,2010,11:0.)。但是，丝胶蛋白作为培养基的血清替代物，通常是用于已分化的细胞、癌症细胞、组织等的培养，尚未将其作为间充质干细胞的培养基添加物。由于其在提升细胞的活性上的优点，发明人首次尝试将丝胶蛋白作为间充质干细胞的血清替代物进行添加。但是，间充质干细胞的培养和一般细胞的培养存在一定的差异。在培养间充质干细胞的过程中，需要维持细胞的增殖活性以及同时防止细胞发生分化，丝胶蛋白的加入是否有效促进间充质干细胞的生长以及细胞干性的维持，是否对细胞的抗逆性能有所影响，在本技术方案产生之前，难以获知。发明人通过实验比较了含有丝胶蛋白和不含有丝胶蛋白的培养方式，结果发现细胞活率不是十分理想，并且细胞经过多次传代之后，细胞出现较为显著的老化现象。本技术方案通过额外加入特定的抗氧剂的方法，克服了丝胶蛋白的缺陷。有丝胶蛋白和n-乙酰-l-半胱氨酸在间充质干细胞培养基中共同使用，在促进细胞抗逆性能以及提升多次传代之后的细胞活性上，产生了协同增效的效果。

20、综上所述，本发明提供的成分明确、稳定的间充质干细胞无血清培养基，不含血清成分，克服了异种蛋白污染和致病微生物的危险，解决了间充质干细胞临床应用的生物安全性问题。同时能够提高细胞的增殖速率和存活率，并保持细胞生物学特性和分化潜能。