一种微生物外囊泡的制备方法与流程

本发明属于外囊泡的制备，涉及一种微生物外囊泡的制备方法。

背景技术：

1、细胞外囊泡(evs)是细胞主动释放的纳米级膜囊泡，基于其生物发生、大小和生物物理性质，可以进一步分类为外泌体、微泡等。尽管细胞外囊泡最初被认为是细胞碎片，并且因此被低估，但evs现在越来越被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体。现有研究已表明细胞外囊泡可以利用治疗一些疾病。目前大部分外囊泡报道集中于哺乳动物细胞外囊泡，也有部分关于植物外囊泡功能效果的报道，而微生物源外囊泡报道相对较少。

2、现有哺乳动物来源外囊泡的制备方法有很多，例如超速离心结合密度梯度离心、超滤、聚合物沉淀等分离纯化方法(extracellular vesicle mimetics:preparation fromtop-down approaches and biological functions,adv healthc mater.2022,28；e2200142.doi:10.1002/adhm.202200142)。其中使用最多的方法是利用超速离心方法制备，但是该方法需要使用超速离心机，而且耗时比较久。

3、近年来，很多研究者开始关注利用细菌来源的外囊泡进行药物递送和疾病治疗等。然而现有的细菌来源外囊泡的制备方式几乎都是利用超速离心的方法制备(li y,max,yue y,et al.rapid surface display of mrna antigens by bacteria-derivedouter membrane vesicles for a personalized tumor vaccine.adv mater.2022may；34(20):e2109984)。

技术实现思路

1、本发明提供了一种微生物外囊泡的制备方法。该方法利用挤压法制备微生物外囊泡，简单便捷，无需使用贵重仪器，而且耗时较短。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种微生物外囊泡的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)将微生物培养液低温离心后，收集菌体沉淀；

5、(2)若微生物为革兰氏阳性菌，在菌体沉淀中加入溶菌酶处理，若微生物为真菌，在菌体沉淀中加入蜗牛酶处理，去除细胞壁后离心收集沉淀，获得原生质体沉淀，若微生物为革兰氏阴性菌，无需处理直接进行步骤(3)；

6、(3)原生质体沉淀或菌体沉淀经pbs洗涤后，用pbs重悬，然后利用脂质体挤出器，依次通过一系列不同孔径的聚碳酸酯核孔膜进行挤压，操作如下：5μm5～15次、1μm 5～15次、0.4μm 3～10次，获得微生物外囊泡。

7、进一步地，步骤(1)中，微生物为细菌或真菌，在本发明具体实施方式中，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母为例。

8、进一步地，步骤(1)中，低温离心条件为：4000×g～5000×g、4℃离心10～15min。

9、进一步地，步骤(2)中，溶菌酶或者蜗牛酶处理条件为：37℃处理1～4h。

10、进一步地，步骤(2)中，离心条件为：3000×g～4000×g离心10～15min。

11、进一步地，步骤(3)中，pbs的洗涤次数为2次以上。

12、进一步地，步骤(3)中，依次通过一系列不同孔径的聚碳酸酯核孔膜进行挤压，操作如下：5μm 10次、1μm 10次、0.4μm 5次。

13、相对于现有技术，本发明具有如下优点：

14、本发明首次利用挤压法制备微生物外囊泡，制备方法简单，容易操作，且制备出来的外囊泡相对于传统的超速离心方法，其背景干净，同体积微生物量的情况下获得的外囊泡的数量更多，约为超速离心方法的5.6倍，且采用的仪器简单，节省时间和成本。

技术特征：

1.一种微生物外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，微生物为细菌或真菌。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，微生物为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或酵母。

4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，低温离心条件为：4000×g~5000 ×g、4℃离心10 ~15 min。

5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，溶菌酶或者蜗牛酶处理条件为：37℃处理1~4 h。

6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，离心条件为：3000×g ~4000×g离心10~15 min。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，pbs的洗涤次数为2次以上。

8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，依次通过一系列不同孔径的聚碳酸酯核孔膜进行挤压，操作如下：5μm 10次、1μm 10次、0.4μm 5次。

技术总结本发明公开了一种微生物外囊泡的制备方法。所述方法先将微生物培养液低温离心后，收集菌体沉淀，对存在细胞壁的菌体沉淀进行处理去除细胞壁后离心收集沉淀，获得原生质体沉淀，之后原生质体沉淀或不存在细胞壁的菌体沉淀经PBS洗涤后重悬，然后利用脂质体挤出器，依次通过一系列不同孔径的聚碳酸酯核孔膜进行挤压，获得微生物外囊泡。本发明首次利用挤压法制备微生物外囊泡，制备方法简单，容易操作，且制备的外囊泡相对于传统的超速离心方法，其背景干净，数量更多，简单高效。技术研发人员：程锦涛,靳远祥,魏朝治,杨桂玲,陈佳莉受保护的技术使用者：湘湖实验室（农业浙江省实验室）技术研发日：技术公布日：2024/8/1