一种大豆CRISPR/Cas9基因编辑载体及基因编辑方法

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地说，它涉及一种大豆crispr/cas9基因编辑载体及基因编辑方法。

背景技术：

1、大豆富含丰富的营养物质，素有“植物肉”的美称，其副加工产品如毛豆、豆腐、豆浆、大豆油、异黄酮、豆粕等是人类以及畜牧业植物蛋白的重要来源，因此大豆也被称为是二十一世纪最健康的食物之一，目前大豆已经成为人们膳食结构中不可或缺的一部分。

2、对于作物来说，基因工程技术最重要的应用之一是快速有效的改良和创造新品种，传统的基因工程育种技术可以通过外源dna整合到植物基因组中，进而实现基因沉默或过表达，从而实现对植物性状的定向改良。但由于大豆是一种转化效率较低的作物，因此利用传统的转基因技术往往无法克服基因敲除不完整，外源基因随机插入等缺陷，对于转基因大豆的育种工作，crispr/cas9系统相对稳健，可实现目标性状的精准改良，从而获得具有特定优异性状的育种资源，并且所创制的新品种与传统育种技术所获得的品种无差异。

3、为了解决上述问题，中国专利(专利公告号：cn104450774a)公布了一种大豆crispr/cas9体系的构建及其在大豆基因修饰中的应用，主要是根据目的基因设计核心序列，将核心序列构建入带有c as9的表达载体中，该体系利用核心序列对目的基因进行识别，cas9对目的基因进行剪切，生物体在断链进行修复的过程中会产生各种突变；上述方案所构建的大豆crispr/cas9体系简单，对大豆基因修饰能够快速、高效的完成；

4、另外目前市面上通过审定的可用于香味性状的大豆材料相对较少，利用传统的转基因技术存在育种年限长，外源基因随机插入等缺点，为此，本发明旨在提供一种大豆crispr/cas9基因编辑载体及基因编辑方法，从而获得具有香味表型的大豆资源。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种大豆crispr/cas9基因编辑载体及基因编辑方法，利用crispr/cas9技术构建了大豆crispr/cas9基因编辑载体，通过转化实验获得具有香味表型的植株，为香味育种提供重要的遗传材料。

2、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种大豆crispr/cas9基因编辑载体，所述载体以pbse401质粒为骨架载体，还包括依次连接的大豆内源u6启动子、sgrna和大豆偏好密码子优化的cas9蛋白的编码基因zcas9；

3、所述sgrna包括在大豆同源基因gmbadh1和gmbadh2的第一外显子上设计的sgrna；

4、所述gmbadh1的靶点序列为sgrna-badh1，其核苷酸序列如seq id no.1所示；所述gmbadh2的靶点序列为sgrna-bad h2，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、本发明进一步设置为：所述载体包括gmbadh1单敲载体pgm badh1-g6、gmbadh2单敲载体pgmbadh2-g1、两基因双敲载体pgmbadhⅰ-badhⅱ。

6、本发明还提供了一种基于大豆crispr/cas9基因编辑载体的基因编辑方法，所述基因编辑方法具体为：

7、s1：查找水稻osbadh1和osbadh2基因的cds序列，根据上述两个基因找到在大豆上与之同源性较高的基因即gmbadh1、g mbadh2；

8、s2：依据步骤s1所述gmbadh1以及所述gmbadh2基因序列特征，分别在其第一外显子处设计sgrna，并对其靶点特异性以及检测脱靶效应进行检测；

9、s3：将u6启动子序列、sgrna和zcas9依次连接后，克隆到载体pbse401质粒，构建敲除载体pgmbadh1-g6、pgmbadh2-g1、pgmbadhⅰ-badhⅱ。

10、本发明还提供了一种基于大豆crispr/cas9基因编辑载体在制备纯合转基因植株的应用：将所述基于大豆crispr/cas9基因编辑载体通过热激转化转入大肠杆菌，过夜培养，挑单克隆进行测序，利用发根检测编辑载体活性，利用农杆菌介导的大豆遗传转化技术进行遗传转化，获得纯合转基因植株。

11、本发明还提供了一种基于大豆crispr/cas9基因编辑载体所制备的纯合转基因植株在香味表型鉴定的应用。

12、通过上述技术方案，本发明提供了针对大豆基因组的精确编辑工具，能够通过设计特定的sgrna实现对目标基因的精准编辑,最大程度地减少了非靶基因的影响，从而提高了编辑的效率和准确性,这对于大豆基因组的精细调控至关重要，特别是在遗传改良中；本发明提供了单基因和双基因编辑载体的选择，使得研究人员可以根据需要采用不同的编辑策略，这种多样性选择使得基因编辑操作更加灵活，能够满足不同基因组结构和特性的编辑需求；

13、上述基因编辑方案不仅适用于大豆基因组的精细调控和遗传改良，还能为培育具有特定性状的基因改良植株提供有效工具，本发明为香味育种提供了重要的遗传材料，具有广泛的应用范围，在大豆遗传改良和农业生产中具有重要的科研和应用价值；基于热激转化、发根检测和农杆菌介导的遗传转化技术的操作步骤相对简单明了，易于实施，这些技术确保了获得高质量的转基因植株，为后续的研究和应用提供了可靠的基础。

14、综上所述，本发明具有以下有益效果：

15、1.本发明通过设计sgrna并利用crispr/cas9基因编辑构建了有效的大豆crispr/cas9基因编辑载体，经过转化实验，本发明获得了具有香味表型的植株，这些植株不仅在基因水平上进行了定向改造，还具备了所需的香味特征，为香味育种提供了极为重要的遗传材料；

16、2.本发明通过crispr/cas9系统设计特定的sgrna可以实现对大豆中目标基因的精确编辑，最小化对非靶基因的影响，提高编辑效率和准确性，这种精准性对于大豆基因组的精细调控和遗传改良至关重要；本发明还提供了单基因和双基因编辑载体的选择，使得研究人员能够根据需要选择最适合的编辑策略，增加了编辑操作的灵活性和可定制性；

17、3.本发明采用大豆偏好密码子优化的cas9蛋白，提高了编辑载体的稳定性和安全性，减少了非特异性剪切风险，这可以确保编辑过程更加安全可控；本发明不仅可以应用于大豆基因组的调控和改良，还可用于培育具有特定性状的基因改良植株，本发明具有重要的科研和应用价值，为大豆遗传改良和农业生产提供了有效的工具；

18、4.本发明基于热激转化、发根检测和农杆菌介导的遗传转化技术，操作简单明了，易于实施，能够获得高质量的转基因植株，为后续研究和应用提供可靠基础。

技术特征：

1.一种大豆crispr/cas9基因编辑载体，其特征是：所述载体以pbse401质粒为骨架载体，还包括依次连接的大豆内源u6启动子、sgrna和大豆偏好密码子优化的cas9蛋白的编码基因zcas9；

2.根据权利要求1所述的一种大豆crispr/cas9基因编辑载体，其特征是：所述载体包括gmbadh1单敲载体pgmbadh1-g6、gmbadh2单敲载体pgmbadh2-g1、两基因双敲载体pgmbadhⅰ-badhⅱ。

3.一种基于权利要求1所述大豆crispr/cas9基因编辑载体的基因编辑方法，其特征是：所述基因编辑方法具体为：

4.一种基于大豆crispr/cas9基因编辑载体在制备纯合转基因植株的应用，其特征是：将权利要求1所述载体通过热激转化转入大肠杆菌，过夜培养，挑单克隆进行测序，利用发根检测编辑载体活性，利用农杆菌介导的大豆遗传转化技术进行遗传转化，获得纯合转基因植株。

5.一种如权利要求4所述基于大豆crispr/cas9基因编辑载体所制备的纯合转基因植株在香味表型鉴定的应用。

技术总结本发明公开了一种大豆CRISPR/Cas9基因编辑载体及基因编辑方法，涉及植物分子生物学领域，其技术方案要点是：包括设计两个sgRNA，并利用CRISPR/CAS9基因编辑技术通过同时编辑GmBADH1和GmBADH2基因，构建了两个单基因编辑载体和一个双基因编辑载体，成功获得了3个GmBADH1单基因编辑株系、3个GmBADH2单基因编辑株系以及3个双基因编辑株系，获得了具有芳香表型的基因编辑突变体，创制了四种新的功能等位基因。本发明可以实现对大豆中目标基因的精确编辑，最小化对非靶基因的影响，提高编辑效率和准确性，并为香味育种提供遗传材料。技术研发人员：邱丽娟,石宇欣,张永芳,李晓菲受保护的技术使用者：中国农业科学院作物科学研究所技术研发日：技术公布日：2024/8/1