一种清风藤中三萜类化合物的提取方法与流程

本发明属于天然植物的提取，具体涉及一种清风藤中三萜类化合物的提取方法。

背景技术：

1、清风藤(sabia japonica maxim.)属于清风藤科清风藤属(sabia)的落叶攀援木质藤本植物，主要分布于我国江苏、安徽、浙江、福建、江西、广东、广西、贵州等地。清风藤叶、根、茎均可入药，由于其祛风通络效果好，古代常用于治疗鹤膝风等风湿痹痛。《本草纲目》中记载“清风藤治风湿流注，历节鹤膝，麻痹瘙痒，损伤疮肿，入药酒中用”。《安徽中草药》记载清风藤：“祛风散寒，除湿消肿”，其茎叶或根均可入药，味苦、辛，性温，归肝经，有祛风利湿，活血解毒的功效，主治风湿痹痛，水肿，脚气，跌打肿痛，骨折，深部脓肿，骨髓炎，皮肤瘙痒等症。现代研究还发现，清风藤具有抗炎、免疫调节、保肝、抗病毒、降血压、抗心率失常、镇咳镇静等多种功效，将其制成片剂(如正青风痛宁片)、注射液(如盐酸青藤碱注射液)等多种制剂应用于临床，在各种炎性疾病、风湿病、关节炎等疾病中取得显著效果。清风藤的化学成分包括三萜类化合物、生物碱、黄酮、苯丙素类、其他苯衍生物类、脂肪酸和烷烃类等，其中，三萜类化合物是清风藤植物所含最为丰富的化合物，也是关键药效成分。

2、目前，从天然产物中提取活性成分主要还是采用有机溶剂提取法，然而有机溶剂使用量过大以及提取的时间过长都会增加生产的成本，同时带来一系列的问题。因此对绿色化工过程的要求也越来越高，尤其在天然产物提取领域，力争采用更加温和的萃取方法，减少有机溶剂使用量并且缩短提取时间。目前，针对清风藤中三萜类化合物的提取和分离的报道很少，其中绝大多数仍采用传统方法例如采用乙醇加热回流的方法进行萃取，采用硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯系统进行梯度洗脱，从而进行成分分离。但是，该过程中使用的有机溶剂的用量较大，同时回流提取时间长，对三萜类化合物的结构可能造成一定破坏，而且提取效率不高，三萜类化合物的纯度也有待提高。

3、因此，有必要采用一种更加绿色、温和的方法对清风藤中三萜类化合物进行分离，并提高清风藤中三萜类化合物的提取得率和纯度。

技术实现思路

1、以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

2、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种清风藤中三萜类化合物的提取方法。本发明的提取方法提取效率高、所得三萜类化合物的纯度高，对三萜类化合物的结构破坏小，有利于保持其药效活性，且操作过程简单，可用于工业生产，且生产成本较低。

3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、本发明提供一种清风藤中三萜类化合物的提取方法，包括以下步骤：

5、s1、将萃取剂和清风藤混合，依次经超声提取、离心，得到粗提液；

6、s2、将所述粗提液用大孔树脂吸附上柱，以体积分数为50％～80％的乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，得到三萜类化合物；

7、其中，所述萃取剂，以质量百分比计，包括：低共熔溶剂50％-90％和水10％-50％，所述低共熔溶剂的制备原料包括氢键供体和氢键受体，所述氢键供体包括正辛酸、正癸酸、月桂酸中的至少一种，所述氢键受体包括薄荷醇；

8、所述大孔树脂选自ab-8型、hpd100型大孔树脂；

9、步骤s2中，所述粗提液的上柱流速为2-4bv/h，所述洗脱液的洗脱的流速为2-4bv/h。

10、本发明通过低共熔溶剂和水的配合，构建在室温条件下具有低黏度和适当极性的低共熔溶剂-水均相体系，其生物相容性强，可进一步通过超声提取法的辅助作用，从而提高对清风藤中三萜类化合物的提取效率，且该过程无需长时间的加热回流，因而对三萜类化合物的结构破坏小，有利于保持其药效活性。

11、具体地，本发明选用薄荷醇作为氢键受体，薄荷醇属于萜烯类物质，分子结构中的环己烷部分能够增加薄荷醇的疏水性，避免低共熔溶剂部分溶解于水中而影响氢键受体和氢键供体的摩尔比和相体积的稳定性，并增强对三萜类化合物的提取效果。另外，本发明选用正辛酸、正癸酸、月桂酸中的至少一种作为氢键供体，具有密度低、且黏度较低(2-14mpas)的优点；而且，此类氢键供体与上述提及的氢键受体所形成的低共熔溶剂疏水性较好，并在水中稳定。

12、清风藤中三萜类化合物由于极性较小，因而可采用弱极性的大孔树脂，利用大孔树脂与三萜类化合物的吸附作用提高从而优化三萜类化合物与其他杂质的纯化分离效果。此外，由于三萜类化合物与特定类型大孔树脂的吸附程度不同，上柱流速、洗脱流速过快或过慢会影响大孔树脂对三萜类化合物的吸附、解吸效果以及三萜类化合物与其他杂质的分离效果；因此，大孔树脂吸附和洗脱过程中需保证适当的上柱流速和洗脱流速。

13、在本发明的一些实施方式中，所述氢键供体选自正辛酸、正癸酸、月桂酸中的任意两种，例如，所述氢键供体选自正辛酸和正癸酸、正辛酸和月桂酸、正癸酸和月桂酸。

14、在本发明的一些优选的实施方式中，所述氢键供体为正癸酸和月桂酸。本发明发现，将正癸酸和月桂酸联合使用，较使用单一的脂肪酸，所得到的低共熔溶剂能够进一步增加三萜类化合物的富集纯度，这可能与低共熔溶剂的疏水性增加，熔点和粘度降低等有关。

15、在本发明的一些优选的实施方式中，所述氢键受体为dl-薄荷醇。

16、在本发明的一些实施方式中，所述低共熔溶剂选自薄荷醇-正癸酸-月桂酸、薄荷醇-正辛酸-月桂酸、薄荷醇-正辛酸-正癸酸、薄荷醇-正癸酸、薄荷醇-正辛酸、薄荷醇-月桂酸。

17、在本发明的一些实施方式中，所述萃取剂中，低共熔溶剂的质量百分比为50％-90％，包括但不限于：55％-90％、60％-90％、65％-90％、70％-90％、75％-90％、80％-90％、55％-85％、60％-85％、70％-85％、80％-85％、60％-80％、65％-80％、70％-80％。

18、在本发明的一些实施方式中，所述萃取剂中，水的质量百分比为10％-50％，包括但不限于：10％-45％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、15％-45％、15％-40％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％。

19、在本发明的一些实施方式中，所述萃取剂中，所述低共熔溶剂和水的体积比为3-5：1。

20、在本发明的一些实施方式中，所述低共熔溶剂由包括氢键供体和氢键受体在内的原料加热至澄清制得。

21、在本发明的一些实施方式中，所述低共熔溶剂的原料还可以包括水。

22、在本发明的一些实施方式中，所述氢键受体和氢键供体的摩尔比为1：0.2-5，包括但不限于：1：0.2-4、1：0.2-3、1：0.2-2、1：0.2-1、1：0.2-0.5、1：0.2-0.4、1：0.3-4、1：0.3-3、1：0.3-2、1：0.3-1、1：0.3-0.5、1：0.4-3、1：0.4-2、1：0.4-1、1：0.5-5、1：0.5-4、1：0.5-2、1：0.5-1、1：1-5、1：1-3、1：1-2。

23、低共熔溶剂原料的用量比对低共熔溶剂的稳定性有影响，不适当的比例会导致低共熔溶剂的稳定性下降，同时也会对提取产生负面影响导致提取得率的下降。

24、在本发明的一些实施方式中，所述加热的温度为60-90℃。

25、在本发明的一些实施方式中，所述加热的时间为1-10h。

26、在本发明的一些实施方式中，在步骤s1之前，将清风藤干燥、粉碎过20-40目，得到清风藤粉末。

27、在本发明的一些实施方式中，所述清风藤和萃取剂的固液比为1:5-30g/ml，包括但不限于：1:5-25g/ml、1:5-20g/ml、1:5-15g/ml、1:5-10g/ml、1:10-30g/ml、1:10-25g/ml、1:10-20g/ml、1:10-25g/ml、1:15-30g/ml、1:15-25g/ml、1:15-20g/ml、1:20-30g/ml、1:20-25g/ml、1:10g/ml、1:20g/ml、1:30g/ml。

28、在本发明的一些实施方式中，所述萃取分两次进行，将两次萃取、超声、离心后得到的粗提液进行合并；其中，每次萃取所加入的萃取剂占总萃取剂质量的40％-60％。

29、在本发明的一些实施方式中，步骤s1为：先将40％-60％的萃取剂和清风藤混合，依次经超声提取、离心，得到第一粗提液和第一沉淀；再将剩下的萃取剂和所得第一沉淀混合，依次经超声提取、离心，得到第二粗提液和第二沉淀，合并第一粗提液和第二粗提液。

30、在本发明的一些实施方式中，所述超声的温度为15-35℃，包括但不限于：15-30℃、15-25℃、15-20℃、20-30℃、20-25℃。

31、在本发明的一些实施方式中，所述超声的频率为700-900w、包括但不限于：700-850w、700-800w、700-750w、750-800w、700w、750w、800w、850w、900w。

32、在本发明的一些实施方式中，所述超声的总时间为20-40min、进一步为25-35min；超声分两次进行，因此，单次超声的时间为10-20min、进一步为12-18min。

33、超声波是一种高频机械波，能够破坏中药材的细胞壁和细胞膜，使试剂更容易渗入到细胞内，与其中的有效成分直接接触并使有效成分溶解于其中，促进提取的快速进行以及有效成分的提取。超声提取法与本发明的萃取剂搭配，可以显著增加三萜类化合物的提取率。

34、本发明对离心的转速和时间不作限制，达到分离的目的即可，通常：所述离心的转速为4000-6000rpm、进一步为4500-5500rpm。所述离心的总时间为5-20min、进一步为5-15min；离心分两次进行，因此，单次离心的时间为2-10min、进一步为4-8min。

35、在本发明的一些实施方式中，所述步骤s1完成后，还包括将所得粗提液通过0.22微米孔径的滤膜进行过滤。

36、在本发明的一些实施方式中，步骤s2前还包括大孔树脂的前处理步骤，包括：将用95％乙醇浸泡24h后的大孔树脂装入层析柱，使其自然沉降，待装柱树脂完成之后，用蒸馏水连续洗涤层析柱至无醇味。

37、在本发明的一些实施方式中，将所述粗提液用大孔树脂静态吸附2-6h，再进行洗脱。

38、在本发明的一些实施方式中，干大孔树脂与所述粗提液的质量比为2-8:1。

39、在本发明的一些实施方式中，步骤s2中，在用所述洗脱液进行洗脱前，先用3-6bv/h的水洗去杂质，至流出液澄清。

40、根据本发明实施方式的清风藤中三萜类化合物的提取方法，至少具备如下有益效果：

41、相较于现有技术中加热回流萃取技术操作繁琐、能耗大，造成能源浪费，且温度过高易导致目标化合物活性丧失等一系列问题。本发明采用包含了低共熔溶剂和水的特定的萃取剂对清风藤进行萃取，低共熔溶剂能够破坏生物质细胞壁，使其中的目标化合物释放，显著地提高了目标成分的提取效果，且根据清风藤中三萜类物质极性较小的特点，本发明的低共熔溶剂可以通过疏水相互作用、氢键相互作用等分子间作用力更加高效地溶解三萜类化合物；另外，水可以降低低共熔溶剂的粘度，更利于提高萃取产量，且能避免部分极性较大的物质的干扰。结合后续的大孔树脂分离纯化步骤，所得提取产物中的三萜类化合物的纯度进一步提高。

42、在本发明的描述中，如果有描述到第一、第二等只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

43、在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

44、本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。

45、当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

46、“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说a组分的质量份为a份，b组分的质量份为b份，则表示a组分的质量和b组分的质量之比a：b。或者，表示a组分的质量为ak，b组分的质量为bk(k为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。

47、“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，a和/或b包括(a和b)和(a或b)。