一种利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法与流程

本发明涉及一种利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，属于免疫检测。

背景技术：

1、在化学发光检测类型中有多种方法，如吖啶酯化学发光平台、光激化学发光平台、电化学发光平台等，均是利用光子数进行测量。其中，光激化学发光平台，即光激化学发光免疫分析平台(lica)，是一类将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体含量的方法，表现出灵敏度高和特异性强等优势。此技术已广泛应用于国内临床实验室，由免疫反应、供体微球和受体微球组成并引入生物素-亲和素放大系统(bas)。两种微球表面均含有功能基团以便于结合生物分子，如抗体和抗原。

2、以夹心法为例，其基本原理为位于供体微球表面的光敏剂受激光(670-690nm)照射后，能启动化学反应致使周围氧分子活化成单线态氧。化学染料和铕螯合物分布于受体微球，前者被单线态氧氧化释放紫外光，后者吸收短波长光并发出610nm左右的光信号，通过单光子计数器检测光信号强度。其中供体微球包被亲和素分子，作为系统的通用偶联物，利用bas系统捕获待测物。此外，由于单线态氧的半衰期极短，在液相中扩散距离在几百纳米内，使得能量传递的基础需要借助两种微球表面包被的抗体与抗原的特异性结合来“拉近”供体微球和受体微球。最后通过剂量-响应函数定量检测相关临床指标浓度。

3、在夹心法的检测中，反应体系包含受体/发光微球-抗体偶联物(fg-ab)、供体/感光微球-链霉亲和素通用包被物(gg-sa)、抗体-生物素标记物(ab-bio)三种组分。其中，gg-sa原料确定，较优包被工艺数量少，同时ab-bio标记工艺成熟，质量控制较容易实现。fg-ab中的抗体既因针对不同种类的标志物改变，也会受配对抗体和目的抗原亲和力差异而更换。每种抗体的等电点不尽相同，抗体与受体微球经过不同包被工艺偶联后，其效价、特异性和亲和力均有较大变化。此外不同包被工艺还会影响包被效率、交联物稳定性以及对特定标志物结合的差异性。

4、综上所述，检测受体微球和蛋白的包被偶联率非常重要，不但可以辅助开发体外诊断试剂盒，还为微球-蛋白结合作用力的微观层面提供理论价值，因此建立一种检测偶联率测定方法很有必要。但是目前暂未报道有关化学发光检测中的偶联率测定方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，可以有效解决上述问题。

2、本发明是这样实现的：

3、一种利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，包括以下步骤：

4、s1，用偶联液按照系列浓度梯度稀释待包被的蛋白纯品，在化学发光检测平台上进行检测，获取检测信号值后通过拟合建立蛋白剂量-信号标准曲线；

5、s2，将所述待包被的蛋白偶联微球，进行封闭，离心，保留第一次离心后上清液；

6、s3，按照步骤s1的方法检测所述第一次离心后上清液中的蛋白信号，代入所述蛋白剂量-信号标准曲线，计算得出第一次离心后上清液中蛋白浓度，再根据第一次离心后上清液中蛋白浓度计算偶联率。

7、在一些实施例中，步骤s1中还加入与待包被的蛋白纯品能特异性识别的物质，与待包被的蛋白纯品混合，使蛋白剂量-信号标准曲线的相关性r≥0.95。

8、在一些实施例中，步骤s1中，所述在化学发光检测平台上进行检测的检测方法为夹心法或竞争法。

9、在一些实施例中，步骤s1中，所述拟合为四参数法拟合。

10、在一些实施例中，步骤s2中，还包括在封闭后加入含有表面活性剂的缓冲液进行清洗，去除物理吸附。

11、在一些实施例中，所述缓冲液选自2-吗啉代乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液或n-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸中的一种或多种。

12、在一些实施例中，所述缓冲液的ph范围为5-8。

13、在一些实施例中，所述表面活性剂在缓冲液中的含量为0.1-1w/v％。

14、在一些实施例中，步骤s2中，所述第一次离心后上清液还需经过滤分离未离心至底部的微球。

15、在一些实施例中，所述化学发光检测平台选自光激化学发光平台、吖啶酯化学发光平台中的一种。

16、本发明的有益效果是：

17、本发明的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，利用抗体抗原特异性识别，避免了封闭剂等干扰，检测准确率高，灵敏度高。

18、本发明的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，可直接在原化学发光检测平台上进行，不需借助第三方，操作简单，成本低。

技术特征：

1.一种利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，其特征在于，步骤s1中还加入与待包被的蛋白纯品能特异性识别的物质，与待包被的蛋白纯品混合，使蛋白剂量-信号标准曲线的相关性r≥0.95。

3.根据权利要求1所述的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，其特征在于，步骤s1中，所述在化学发光检测平台上进行检测的检测方法为夹心法或竞争法。

4.根据权利要求1所述的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，其特征在于，步骤s1中，所述拟合为四参数法拟合。

5.根据权利要求1所述的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，其特征在于，在步骤s2中，还包括在封闭后加入含有表面活性剂的缓冲液进行清洗，去除物理吸附。

6.根据权利要求5所述的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，其特征在于，所述缓冲液选自2-吗啉代乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液或n-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，其特征在于，所述缓冲液的ph范围为5-8。

8.根据权利要求5所述的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，其特征在于，所述表面活性剂在缓冲液中的含量为0.1-1w/v％。

9.根据权利要求1所述的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，其特征在于，步骤s2中，所述第一次离心后上清液还需经过滤分离未离心至底部的微球。

10.根据权利要求9所述的利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，其特征在于，所述化学发光检测平台选自光激化学发光平台、吖叮酯化学发光平台中的一种。

技术总结本发明提供一种利用光子数测量微球蛋白偶联率的方法，包括以下步骤：S1，用偶联液按照系列浓度梯度稀释待包被的蛋白纯品，在化学发光检测平台上进行检测，获取检测信号值后通过拟合建立蛋白剂量‑信号标准曲线；S2，将所述待包被的蛋白偶联微球，进行封闭，离心，保留第一次离心后上清液；S3，按照步骤S1的方法检测所述第一次离心后上清液中的蛋白信号，代入所述蛋白剂量‑信号标准曲线，计算得出第一次离心后上清液中蛋白浓度，再根据第一次离心后上清液中蛋白浓度计算偶联率。所述方法避免了封闭剂等干扰，检测准确率高，灵敏度高。技术研发人员：何升姣,陈东慧,刘妍琳,张伟受保护的技术使用者：厦门宝太和瑞生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/16