一种递送基因药物和小分子药物的近电中性聚离子复合物胶束及其制备与应用

本发明属于纳米药物递送领域，具体涉及一种递送基因药物和小分子药物的近电中性聚离子复合物胶束及其制备与应用。

背景技术：

1、肝癌是我国癌症发病率第四、死亡率第二的常见恶性肿瘤，全球45.3％的肝癌发病人数在中国。肝癌预后性差，肝癌复发率高达70％，总体5年生存率仅7％～10％，这严重威胁了我国人民的生命健康。肝癌早期可以通过手术和消融的方法治疗，但70％～80％患者确诊已经是中晚期，只能选择系统治疗，靶向药物如仑伐替尼与索拉非尼作为一线治疗药物可以一定程度上使患者获益，但会产生耐药性。目前，免疫检查点抑制剂已被用于肝癌的治疗，如纳武利尤单克隆抗体和帕博利珠单克隆抗体，已经成为索拉非尼耐药患者的治疗方案。免疫检查点抑制剂与靶向药物、化疗药物和局部治疗的联合方案也在不断地探索用于肝癌治疗。

2、肝癌是一种促炎性免疫细胞少而免疫抑制细胞(如辅助t细胞、髓源性免疫抑制细胞和m2型巨噬细胞等)多的“冷”肿瘤，而免疫检查点抑制剂只是通过靶向抑制通路间接提高cd8+t细胞杀伤力，而并没有改变肝癌的免疫原性。近年研究表明，表观遗传调控可能在肝癌的起因和发展过程具有重要作用，表观遗传参与了肝癌细胞一系列活动，如增殖、侵袭、转移和代谢等生命活动，值得注意的是表观遗传可以调肿瘤微环境免疫细胞的免疫应答。研究表明组蛋白去乙酰化酶8(hdac8)在肝癌中处于过表达状态。特异性hdac8抑制剂pci-34051，能够重新激活肝癌细胞中t细胞转运因子表达，从而募集更多的cd8+t细胞杀死肝癌细胞，研究表明，pci-34051和pd-l1抗体联合应用能够重塑肿瘤微环境，将“冷”肿瘤逆转为“热”肿瘤，通过强大的免疫反应根除肝癌。因此，将表观遗传药物同免疫药物联合用于治疗肝癌的方案可行。但是pci-34051这个药物溶解性差，治疗效果呈剂量依耐性。随着纳米技术的发展，聚合物能有效递送溶解性差药物，以提高pci-34051的生物利用度。

3、由rnai技术衍生出来的sirna药物已经成为新药研发领域的一个重要研究方向，sirna能高效沉默目的基因从而阻断目标蛋白的表达，但sirna作为一种基因药物，带负电，不容易跨越生物屏障而被体内的酶降解。通常阳离子载体被用来递送sirna，但是由于其与细胞膜的强烈的静电作用，产生了强大的毒性，而且转染效率低、阳离子基因复合物不稳定。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种递送基因药物和小分子药物的近电中性聚离子复合物胶束及其制备与应用，解决了现有阳离子载体递送基因药物毒性大、转染效率低和不稳定的问题，设计合成了一种递送基因药物和小分子药物的近电中性聚离子复合物胶束，并用于肝癌的表观免疫治疗。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种递送基因药物和小分子药物的近电中性聚离子复合物胶束，该复合物胶束由包含聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸、聚[3-(甲基丙烯酰氨基)-丙基三甲基氯化铵]、基因药物和小分子药物组装成的；

3、所述聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸具有如式(ⅰ)所示的结构：

4、

5、在所述式(ⅰ)中，n为20～452；m为10～200；当n为20～452；m为10～200时制得的胶束具有良好的生物相容性、稳定性和血液滞留性。

6、所述聚[3-(甲基丙烯酰氨基)-丙基三甲基氯化铵]具有如式(ⅱ)所示的结构式：

7、

8、在所述式(ⅱ)中，m为10～200，当m为10～200时制得的胶束具有良好的生物相容性、稳定性和流体力学尺寸。

9、所述基因药物为mrna、dna、sirna、质粒和反义寡核苷酸中的任意一种或两种以上；所述小分子药物为组蛋白去乙酰化酶8抑制剂。

10、优选地，所述基因药物为能够敲除程序性死亡配体1的sirna序列sipdl1；所述组蛋白去乙酰化酶8抑制剂为n-羟基-1-(4-甲氧基苄基)-1h-吲哚-6-甲酰胺pci-34051。

11、优选地，所述胶束的粒径为20～200nm；所述聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸、聚[3-(甲基丙烯酰氨基)-丙基三甲基氯化铵]、基因药物和小分子药物的质量比为275∶166∶15∶250，其他质量比会导致胶束粒径、粒径分布变大，稳定性变差。

12、本发明提供了一种如所述的近电中性聚离子复合物胶束的制备方法，该方法包含：

13、将带负电的聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸、基因药物和小分子药物溶于有机溶液中，加入聚[3-(甲基丙烯酰氨基)-丙基三甲基氯化铵]，立即涡旋或超声，得到所述近电中性聚离子复合物胶束；所述聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸带的负电荷总数与聚[3-(甲基丙烯酰氨基)-丙基三甲基氯化铵]带的正电荷总数之比为1∶(1～1.2)。

14、优选地，所述聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸由以下方法制得：

15、(1)甲氧基聚乙二醇胺和4-氰基-4-(苯碳硫酰基硫代)戊酸n-羟基琥珀酰亚胺酯在无水二氯甲烷中反应制备聚乙二醇-4-氰基-4-(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酰胺，记为pegn-cta；

16、(2)将n-甲基丙烯酰基甘氨酸、引发剂和步骤(1)制备的pegn-cta发生聚合反应，得到所述聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸，记为pegn-pnmvgm。

17、更优选地，所述引发剂为偶氮二氰基戊酸；所述甲氧基聚乙二醇胺和4-氰基-4-(苯碳硫酰基硫代)戊酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的质量比为267∶60，其他质量比也能合成出该结构类型聚合物，但产物聚合度和所带电荷不同，制备得到的纳米胶束稳定性、基因转染效率、生物相容性变差。

18、优选地，所述聚[3-(甲基丙烯酰氨基)-丙基三甲基氯化铵]通过4-氰基-4-硫代丙基硫代戊酸、[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]三甲基氯化铵和引发剂发生可逆加成-断裂链转移反应得到的，记为pmaptac。

19、更优选地，所述引发剂为偶氮二氰基戊酸，所述4-氰基-4-硫代丙基硫代戊酸和[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]三甲基氯化铵的质量比为5∶217，其他质量比也能合成出该结构类型的聚合物，但产物聚合度和所带电荷不同，制备得到的纳米胶束稳定性、基因转染效率、生物相容性变差。

20、本发明提供了一种如所述的近电中性聚离子复合物胶束在制备治疗肝癌药物中的应用。

21、优选地，所述治疗肝癌药物包含基因治疗、免疫治疗和化疗的药物。

22、本发明的一种递送基因药物和小分子药物的近电中性聚离子复合物胶束及其制备与应用，解决了现有阳离子载体递送基因药物毒性大、转染效率低和不稳定的问题，具有以下优点：

23、1、本发明的聚离子复合物胶束是通过控制两种聚合物的正负电荷比例，从而控制纳米胶束的电位，使纳米胶束稍微带正电，趋近于近电中性，既能利于基因药物的转染，又能降低纳米胶束的毒性，引入带负电的聚合物还能有效封装sirna，具有毒性小基因染效率高的特点。

24、2、本发明的聚离子复合物胶束能在原位肝癌部位而不是肝的正常细胞部位稳定蓄积，对肝癌具有较好的治疗效果。