复合物及其制备方法与作为粘合剂的应用

本发明涉及生物材料，尤其涉及复合物及其制备方法与作为粘合剂的应用。

背景技术：

1、干燥和潮湿条件下具有超强粘附性能的粘合剂在许多高技术和临床应用中发挥着重要作用。尤其是可用于软组织粘附和伤口止血的生物粘合剂因其作为手术缝合线等现有材料的潜在替代品而引起了广泛关注。然而，商用的止血材料和组织粘合剂通常对湿组织表面的粘附力较弱，这在很大程度上限制了实际的临床应用。尽管目前已经开发出一些具有更强性能的粘合剂，但紫外线照射和化学反应的引入会对创伤组织产生二次伤害。此外基于共价交联的化学类粘合剂的生物相容性和可降解性需要进一步改进，这对生物安全性至关重要。因此，亟需发展一种兼具优异粘附性能、生物相容性和可降解性的新型组织粘合剂。

2、以贻贝和藤壶分泌物为代表的天然蛋白粘合剂，对各种界面均具有优异的粘附特性。更重要的是，此类蛋白粘合剂还具有良好的生物相容性和可降解性，为新型组织粘合剂的开发提供了灵感。深入的粘附机理研究表明，天然蛋白粘合剂中多重分子间作用力和多尺度组装结构对粘附性能起着关键作用。随着基因工程技术的发展，许多基于藤壶和贻贝粘附蛋白的重组蛋白成功合成并用于粘合剂的制备。然而，对天然粘附蛋白的部分功能域重构缺乏分子水平的理性设计，使多重分子间相互作用力被削弱。同时，粘合剂中的多尺度组装结构也难以被有效人工重建，从而导致重组蛋白粘合剂与天然粘合剂的粘附性能存在一定差距。所以开发可以精确操控多重分子间作用力和多尺度组装的粘合体系对于粘附性能的提高具有重要意义。

3、受分子工程启发，在分子尺度上对氨基酸序列或其它组分进行精确编码，可以有效的引入多种分子间作用力，对粘附蛋白的组装和性能优化非常重要。最近，通过分子工程策略已经成功开发出具有增强粘附性能的蛋白粘合剂。尽管蛋白网络中的相互作用力得到有效增强，但粘合剂多尺度组装结构的形成需要更复杂的分子设计。两亲性多肽分子的自组装为拓扑结构的人工合成提供了有效途径，包括一维（1d）、二维（2d），甚至是超结构网络结构。这同时也为具有多尺度组装结构的蛋白粘合剂制备开辟了一个令人振奋的机会。然而，如何通过两亲性多肽的设计来制备高性能宏观材料，特别是超强蛋白粘合剂，至今仍未开发出有效的解决方案。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供复合物及其制备方法与作为粘合剂的应用。本发明中的粘合剂具有优异的粘附特性，适用硬底片和软底片，同时具有优异的生物相容性，可用于内脏止血和皮肤伤口修复。

2、本发明提供的复合物，其制备原料包括磷酸化多肽和正电性类弹性蛋白；

3、所述磷酸化多肽的结构为：fmoc-x1x2-psgss；x1和x2独立地选自y或f；

4、所述正电性类弹性蛋白为mgagp[(gvgvp)(gkgvp)m]ngwph6，其中n为8～15的整数；m为5～12的整数；序列中k可替换为精氨酸r。

5、本发明所述磷酸化多肽的氨基酸序列分别为fmoc-ffpsgss、fmoc-fypsgss和fmoc-yypsgss，其中fmoc代表多肽c端的保护基团，为9-芴甲氧羰基，p代表c端第三位s氨基酸被磷酸化修饰。

6、如前所述磷酸化多肽的结构为：

7、、或。

8、本发明所述正电性类弹性蛋白具有高正电荷密度，其氨基酸序列为mgagp[(gvgvp)(gx3gvp)9]8gwph6。类似的，x3为k或r。前期实验表明，该类弹性蛋白的效果相对于其他类弹性蛋白而言，更适合与fmoc-x1x2-psgss组合，形成的粘合剂具有更优秀的性能。

9、一些实施例中，所述磷酸化多肽和正电性类弹性蛋白的摩尔比为(10~50):1，一些具体实施例中，所述磷酸化多肽和正电性类弹性蛋白的摩尔比为（20~30）:1，更具体的，所述磷酸化多肽和正电性类弹性蛋白的摩尔比为（23~25）:1，作为优选，所述磷酸化多肽和正电性类弹性蛋白的摩尔比为23:1、24：1或25:1。

10、本发明所述复合物的制备方法，包括：

11、所述正电性类弹性蛋白溶解于水，获得类弹性蛋白溶液；

12、所述磷酸化多肽溶解于水，自组装形成多肽纳米纤维后，与所述类弹性蛋白溶液混合，反应后弃除上清，获得所述复合物。

13、本发明所述复合物中的磷酸化多肽均为化学固相合成得到；所述正电性类弹性蛋白是通过生物合成法得到的具有高正电荷密度的重组蛋白，以工程化大肠杆菌为宿主细胞，根据蛋白氨基酸序列构建质粒，然后导入大肠杆菌进行蛋白表达，在正电性类弹性蛋白表达的过程中根据纯化的需要可引入标签，也可以不引入，本发明对此不做限定。标签的引入对复合物的制备和性能没有影响。

14、在本发明所述制备方法中，所述类弹性蛋白溶液中类弹性蛋白溶液的浓度为50~200mg/ml，一些实施例中，所述类弹性蛋白溶液的浓度为80~120mg/ml，一些具体实施例中，类弹性蛋白溶液的浓度为100 mg/ml。

15、在本发明所述制备方法中，所述磷酸化多肽溶解于水的浓度为1~5mg/ml，一些实施例中，所述磷酸化多肽的浓度为2~3mg/ml，一些具体实施例中，磷酸化多肽的浓度为2.5mg/ml。

16、在本发明所述制备方法中，所述自组装的条件包括：ph值为7.4，4 ℃，2~12 h。具体的，将磷酸化多肽溶解于ph值为9的水，然后调节ph值为7.4

17、在本发明所述制备方法中，所述反应的条件包括：按照正负电荷比1.5:1将电性类弹性蛋白溶液与多肽纳米纤维混合，室温震荡反应约3min。

18、所述反应过程中，正电性类弹性蛋白与磷酸化多肽通过静电作用络合形成了相分离。所述反应后，获得透明的凝聚体经离心弃除上清即为复合物。所述离心的参数包括转速为6000~13000 rpm，离心时间为3~5 min。

19、本发明实施例中，所述弃除上清后还经过冻干的步骤，所述冻干的时间为5~10min。

20、实验表明，凝聚体经离心后仍保持液态且流动性降低，粘稠度也有增加。含水量会影响粘合剂对软组织的粘附效果（猪皮，粘合后立即进行测试），对硬底片（铁、铝等硬底片的粘附性能测试是在将粘合剂固化5天后进行测试，水分充分挥发）的粘附效果影响不大。对硬底片粘合时通常冻干5分钟；软底片粘合时通常冻干10分钟。

21、本发明还提供了一种粘合剂，其包括如前所述的复合物，或包括如前所述制备方法制得的复合物。

22、本发明提供一种基于多肽纳米纤维的蛋白粘合剂，具体由磷酸化多肽和正电性类弹性蛋白组成；所述多肽纳米纤维由磷酸化多肽自组装形成，磷酸化多肽氨基酸序列为fmoc-ffpsgss或fmoc-fypsgss或fmoc-yypsgss，正电性类弹性蛋白为具有高正电荷密度的重组蛋白，氨基酸序列为mgagp[(gvgvp)(gx3gvp)9]8gwph6。本发明实施例通过化学固相合成法制备出了上述三种磷酸化多肽，同时通过大肠杆菌表达合成出了正电性类弹性蛋白，进一步将两种原料的水溶液进行混合得到凝聚体，简单冷冻干燥操作后即可制备出用于内脏止血和皮肤伤口修复的多肽纳米纤维基蛋白粘合剂。所得产品对金属、木材等硬底片和生物组织等软底片表现出优异的粘附特性，还展现出良好的的生物相容性，可用于内脏止血和皮肤伤口修复。本发明制备工艺简单、无需特殊设备、成本低、绿色环保，可开发为下一代医用止血和组织修复材料。