一种提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物、方法及其应用

本发明属于生物，尤其是涉及维生素c、l-肉碱和thpo的联合施用，以提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物、方法及其应用。

背景技术：

1、过去几十年，哺乳动物体外胚胎生产技术广泛应用于家畜遗传改良、良种扩繁和人类辅助生殖等领域。然而，体外胚胎存在发育效率低、胚胎质量差的技术瓶颈，一直难以突破。目前普遍认为，由于体外培养环境有别于体内发育环境，尤其是卵子体外成熟培养液成分不完善引发卵子体外成熟不充分，是导致体外胚胎发育潜能低、尤其是移植后胚胎妊娠率低的重要原因，极大限制体外胚胎生产技术的发展。因此，优化卵子体外成熟培养液成分，提高卵子成熟质量、进而提高后续胚胎发育潜能，是目前改善体外胚胎发育效率和质量，完善体外胚胎生产技术最直接有效的策略。

2、卵子成熟受到多种信号的严格调控，卵子在体内随着卵泡发育而逐渐发育至成熟排卵，为卵子高质量成熟提供了良好的物质和环境保证。然而，卵子体外成熟环境是人造培养液，且培养环境的氧气浓度高于体内卵泡内氧气浓度，容易造成卵子氧化应激，无法满足卵子高质量成熟需求。此外，卵子内的代谢，尤其是脂质代谢，为卵子成熟提供足够的能量和调节剂。体内环境下，卵子内形成一个复杂而动态的脂代谢调节网络，但起核心作用的关键因素或途径仍然未知。虽然脂质代谢产物不可或缺，但长期暴露于高脂环境也会对卵母细胞造成不可逆的损害。

3、目前，已经报道了较多通过在体外成熟培养液中添加抗氧化剂或促进脂代谢提高卵子体外成熟质量的策略，如卵子体外成熟液添加半胱胺可提高卵母细胞内谷胱甘肽含量，降低氧化应激损伤；白藜芦醇、槲皮素、褪黑素可降低卵子内活性氧水平和早期受精胚胎的细胞凋亡水平，增加卵子内线粒体数量和atp产生量。cn100432219a公开了一种牛卵子体外成熟培养液，其主要添加抗氧化剂茶多酚，清除羟基自由基、过氧化物阴离子等自由基，从而提高了牛卵子体外成熟比率。cn110846272a公开了一种降低卵子中活性氧含量的方法，其是通过在基础培养液中添加5-20%成熟卵泡液，从而获得了一种提高猪卵子体外成熟率的培养液。

4、然而，由于氧化应激及脂代谢调节的复杂性，目前针对卵子体外成熟的矫正技术仍然存在发育效率低和质量差的问题。

5、背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明基于前期研究的结果，即在牛、羊的壁层颗粒细胞中存在血小板生成素(thrombopoietin，thpo)基因的大量表达。thpo基因编码的主要功能蛋白是一种体液生长因子，是巨核细胞增殖、成熟以及血小板生成所必需的，并能影响造血干细胞线粒体代谢。基于上述研究，本发明创造性地研发出一种卵子体外成熟培养的组合物，并建立新的卵子体外成熟方法。具体地，本发明提供提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物及应用。

2、本发明的第一方面，提供一种提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物，其包括选自维生素c或其前体、l-肉碱和thpo中的两种以上的调节剂。

3、在某些实施方案中，根据本发明所述的提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物中，所述组合物包含(a)-(d)中的任一组合：

4、(a) 维生素c或其前体和l-肉碱，且所述维生素c或其前体与所述l-肉碱的重量比为1：2-50；

5、(b) 维生素c或其前体和thpo，且所述维生素c或其前体与所述thpo的重量比为200-1000：1；

6、(c) l-肉碱和thpo，且所述l-肉碱与thpo的重量比为1000-10000：1；

7、(d)维生素c或其前体、l-肉碱和thpo，且所述维生素c或其前体、所述l-肉碱与所述thpo的重量比为(200-1000): (1000-10000):1。

8、在某些实施方案中，根据本发明所述的提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物中，所述维生素c或其前体的量能够使维生素c在体外培养时的工作浓度达到0.5-1000 μg/ml；所述l-肉碱的量能够使l-肉碱在体外培养时的工作浓度达到10-1000μg/ml；或者所述thpo的量能够使thpo在体外培养时的工作浓度达到0.001-5 μg/ml。

9、在某些实施方案中，根据本发明所述的提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物中进一步包括基础培养液。

10、本发明第二方面，提供一种提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的方法，其包括在体外使卵子与第一方面所述的组合物接触的步骤。

11、在某些实施方案中，根据本发明所述的提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的方法中，所述改善包括提高胚胎发育效率和/或质量。

12、本发明的第三方面，提供一种用于改善卵子体外成熟的方法，其包括在体外使卵子与第一方面所述的组合物接触的步骤。

13、在某些实施方案中，根据本发明所述的用于改善卵子体外成熟的方法，其中，所述改善包括提高囊胚发育率、囊胚细胞数、降低囊胚凋亡细胞数、提高胚胎移植后妊娠率。

14、本发明的第四方面，提供第一方面所述的组合物在动物遗传改良、良种扩繁、体外胚胎生产或培养中的用途。

15、据国际胚胎组织协会(iets)发布的数据显示，自2016年开始牛的体外胚胎数量已经超过体内胚胎数量，且呈现出逐年升高的趋势，因此体外胚胎生产技术已经成为良种资源高效利用的有效途径。本发明针对卵子体外成熟质量差导致的胚胎发育率低、后续发育潜能低等问题，提供了有效的矫正途径和方法，大幅度提高了体外受精后胚胎的发育率和质量，为畜牧产业的升级提供了有效策略，同时在辅助生殖领域，特别是优质胚胎的获得方面具有重要的参考价值。因此，本发明为我国推进家畜体外胚胎生产将产生巨大经济价值和社会价值。

技术特征：

1.一种提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物，其特征在于，包括选自维生素c或其前体、l-肉碱和thpo中的两种以上的添加组分。

2.根据权利要求1所述的提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物，其特征在于，所述组合物包含(a)-(c)中的任一组合：

3. 根据权利要求2所述的提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物，其特征在于，所述维生素c或其前体的量能够使维生素c在体外培养时的工作浓度达到0.5-500 μg/ml；所述l-肉碱的量能够使l-肉碱在体外培养时的工作浓度达到10-1000 μg/ml；或者所述thpo的量能够使thpo在体外培养时的工作浓度达到0.001-5 μg/ml。

4.根据权利要求1所述的提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物，其特征在于，进一步包括基础培养液。

5.一种提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的方法，其特征在于，包括在体外使胚胎与根据权利要求1-4任一项所述的组合物接触的步骤。

6.根据权利要求5所述的提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的方法，其特征在于，所述提高包括提高胚胎发育效率和/或质量。

7.一种用于改善卵子体外成熟的方法，其特征在于，包括在体外使卵子与根据权利要求1-4任一项所述的组合物接触的步骤。

8.根据权利要求7所述的用于改善卵子体外成熟的方法，其特征在于，所述改善包括提高囊胚发育率、囊胚细胞数、降低囊胚凋亡细胞数、提高胚胎移植后妊娠率。

9.根据权利要求1-4任一项所述的组合物在动物遗传改良、良种扩繁、体外胚胎生产或培养中的用途。

技术总结本发明公开了一种提高卵子体外成熟质量及体外受精后胚胎妊娠率的组合物、方法及其应用。本发明针对卵母细胞体外成熟过程中代谢紊乱导致的体外成熟率低、后续胚胎发育潜能差等问题，提供包括维生素C、L‑肉碱和血小板生成素中两种以上调节剂的组合物，调节卵母细胞代谢方式，进而大幅度提高卵母细胞体外成熟率和后续胚胎发育潜能。本发明不仅为提高家畜的体外胚胎生产效率，还可为改善人类辅助生殖卵子体外成熟质量提供参考。该方法简单易行，安全高效，具有巨大的应用价值和广泛的应用前景。技术研发人员：田见晖,席广银,郝佳,岳媛,王书敏,安磊,郭敏受保护的技术使用者：中国农业大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20