一种ITS标志物在筛选高产酸唾液链球菌嗜热亚种中的应用的制作方法

本发明属于微生物和基因工程，特别涉及一种its标志物在筛选高产酸唾液链球菌嗜热亚种中的应用。

背景技术：

1、酸奶是以牛奶或羊奶为原料，经杀菌、发酵后获得的一种结构中含有蛋白质、多糖和脂质的复杂凝胶体系，目前已成为我国第一大发酵乳制品。酸奶中除含有高水平蛋白质、乳糖、钙和维生素等基本营养物质外，还包含相互作用的微生物，这些微生物被认为对人体肠道健康有益，可以缓解乳糖消化不良症状和缩短轮状病毒引起的腹泻，预防便秘等消化系统疾病，增强免疫力和降低感染风险等。

2、唾液链球菌嗜热亚种和保加利亚乳杆菌通常被称为“酸奶发酵剂”，共同发酵牛奶后形成酸奶。其中，唾液链球菌嗜热亚种是用于生产酸奶的主要发酵剂菌株。在发酵过程中，唾液链球菌嗜热亚种在β-半乳糖苷酶的作用下把乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，并转化为乳酸，当乳中的ph值小于5.5，酪蛋白开始凝固成胶束，形成特定组织结构。研究发现，不同的唾液链球菌嗜热亚种对酸奶的发酵时间和ph值等特性有显著影响，其高酸化率缩短发酵时间，为酸奶提供特有的酸度，同时有机酸含量及其比例又使酸奶具有独特的浓郁风味。然而，国内发酵剂菌株长期以来存在产酸能力弱，风味单一和乳清析出现象，使其发酵产品在货架期内不稳定，与国外相比缺乏竞争力。因此，筛选高产酸能力的唾液链球菌嗜热亚种菌株引起广泛关注。

3、在细菌染色体中，核糖体位点被用于分类学和/或系统发生学研究。位于16s和23srrna基因之间的内部转录间隔区（its）为物种/菌株水平的精细鉴定提供了极好的工具。its区域在包含trna基因的区域显示出高度保守的序列，而在间隔末端则显示出相对稳定的区域，这些区域通过与16s rrna基因上游和 23s rrna 基因下游的片段配对形成二级结构。its序列分析已成功应用于多个细菌物种的鉴定和区分，但现有研究并未将its序列分析应用于唾液链球菌嗜热亚种的精细筛选鉴定中。

技术实现思路

1、针对现在缺乏基于its序列筛选具有高产酸能力的唾液链球菌嗜热亚种，本发明提出了一种在发酵乳中基于its-i型序列筛选具有高产酸能力的唾液链球菌嗜热亚种的方法，该方法可以定向筛选发酵乳中具有高产酸能力的唾液链球菌嗜热亚种，具备高效和特异性筛选的特点，在发酵乳的制备中具有很重要的应用价值。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、本发明的第一方面提供了一种鉴定乳制品中具有高产酸能力的唾液链球菌嗜热亚种的its标志物，其中，所述的its为its-i型，其具有seq id no:1所示的序列：

4、cgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccagccgcctaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacctcctttctaaggaaaaacggaatgtacttgagtttcttatttagttttgagaggtcttgtggggccttagctcagctgggagagcgcctgctttgcacgcaggaggtcagcggttcgatcccgctaggctccattgaatcgaaagattcaagtattgtccattgaaaattgaatatctatatcaaattccatatgtaagtaattacatatagatagtaacaagaaaataaaccgaaacgctgtgaatatttaatgagttaggtcgaaaggccaaaaataaggttaagttaataagggcgcacggtggatgccttggcactagaagccgatgaaggacgtgactaacgacgaaatgctttggggagctgtaagtgagcaatgatccagagatgtccgaatgggggaacccggcaggtaatgcctgtcactcattactgttaaggtaatgtagaggaagacgcagtgaactgaa。

5、本发明的第二个方面是提供了第一方面所述的its标志物在筛选鉴定乳制品中具有高产酸能力的唾液链球菌嗜热亚种中的应用。

6、本发明的第三个方面是提供了一种特异性检测第一方面所述的its标志物的产品，其中，所述的产品为引物组和/或探针。

7、进一步的，其中所述的产品为引物组，所述的引物组为：

8、16s-f：5′-ttgtacacaccgcccgtc-3′（seq id no:2）；和

9、23s-r：5′-ggtaccttagatgtt tcag-3′（seq id no:3）。

10、本发明的第四个方面是提供第三方面所述的产品在筛选鉴定乳制品中具有高产酸能力的唾液链球菌嗜热亚种中的应用。

11、本发明的第五个方面是提供了一种筛选乳制品中具有高产酸能力的唾液链球菌嗜热亚种的方法，所述的方法包括如下步骤：

12、（1）菌种活化；

13、（2）提取待测唾液链球菌嗜热亚种菌株的基因组dna，采用pcr扩增its序列；

14、（3）its序列比对分析；

15、（4）选择具有seq id no:1所示的its-i型序列的唾液链球菌嗜热亚种菌株作为具有高产酸能力的菌株。

16、进一步的，所述方法还包括以下步骤：

17、（5）将步骤（4）筛选获得的唾液链球菌嗜热亚种接种至发酵乳基中，进行产酸量检测，从而验证唾液链球菌嗜热亚种的产酸能力。

18、进一步的，在发酵乳基中产酸量检测的步骤为：

19、1）纯牛奶加热至90~100℃，保持5min，获得乳基；

20、2）将步骤（4）筛选获得的菌株采用2%（v/v）接种至m17-乳糖液体培养基，在42 ±1℃下培养12h，完成菌种活化；

21、3）活化后的菌株按照国标《食品安全国家标准 食品微生物检验 乳酸菌检验》（gb/4789.35 - 2016）规定进行10倍梯度稀释，在42 ± 1℃条件下培养36 - 48 h，测定发酵液中的微生物数量确定菌株在稳定期的数量，并计算在乳基中的添加量；

22、4）按照1×107 cfu/ml添加量接种于乳基中，发酵获得发酵基料；

23、5）按照国标gb/5009.239–2016规定，对发酵基料进行酸度的测定、获得吉尔涅尔度（°t）；和/或

24、6）采用外标法检测发酵基料中的乳酸含量。

25、进一步的，pcr扩增中使用的引物为：

26、16s-f：5′-ttgtacacaccgcccgtc-3′（seq id no:2）；和

27、23s-r：5′-ggtaccttagatgtt tcag-3′（seq id no:3）。

28、本发明第六个方面是提供了第五方面所述的方法在筛选鉴定乳制品中具有高产酸能力的唾液链球菌嗜热亚种中的应用。

29、本发明相比现有技术的有益效果为：

30、1、本发明首次提出利用its标志物筛选发酵乳中高产酸的唾液链球菌嗜热亚种，通过its型序列比较，确定唾液链球菌嗜热亚种的its序列分型（its-i型、its-ii型、its-ⅲ型和its-ⅳ型），可以筛选高产酸唾液链球菌嗜热亚种；

31、2、据本发明筛选发酵乳中高产酸的唾液链球菌嗜热亚种，发明通过its-i型序列，使唾液链球菌嗜热亚种在乳基中快速高产酸，5小时内产生更多的乳酸；

32、3、与传统筛选方法比较，本发明通过its-i型序列快速筛选高产酸的唾液链球菌嗜热亚种，具有高效和特异性筛选的特点，避免传统筛选方法中单一性和非特异性筛选的缺陷。