一种快速标记小鼠多脏器血管和淋巴管并透明化的新方法

本发明涉及生物组织器官标记领域，具体涉及一种快速标记小鼠多脏器血管和淋巴管并透明化的新方法。

背景技术：

1、透明化方法其重点是脱去组织中的脂质，降低脂质造成的漫反射，从而使组织具有较高的透明度。组织透明化的目标是将组织转变成半透明或完全透明的样本，适于执行超级深度的光学观察，从而对整个器官或组织的细节进行成像，同时保留其结构。

2、现有常用的组织透明化技术大致可分为三类：

3、1.电泳依赖的透明化方法：如clarity(clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatibletissue-hydrogel)。clarity先以聚丙烯酰胺等包裹组织，后将组织浸没于特定的缓冲buffer，利用电泳的方式将脂质从组织中脱去。近年来，相关技术的进步催生了多种clarity同类的透明化方法，包括pact-pars、基于随机电传输的清除、clarity-tde和act-presto。

4、2.脱水，调节组织的折射率：如3disco(3d imaging of solvent-clearedorgans)。3disco采用脂溶性透明化试剂对组织进行透明化，该法采用对gfp保护较好的四氢呋喃(the)和二苄醚(dbe)。

5、3.去除生色基团后的折射率调整：如cubic(clear,unobstructed brain/bodyimaging cocktails and computational analysis)。cubic是应用可溶于水的透明化试剂清除脂质并调整组织折射率以实现透明化组织的方法。gradinaru团队极大地改进了这一类方法，改进包括优化水凝胶固定、扩张组织等实现了更有效的透明化(尤其是硬组织的透明化)。

6、可兼容组织透明化的血管标记方法有三大类：

7、1.抗体标记法：利用抗原-抗体的特异性结合反应，采用针对血管内皮细胞等血管特征细胞的标志性蛋白作为抗原的抗体，特异性地对血管特征细胞进行标记，从而实现对血管进行标记的方法。

8、2.转基因标记法：通过对血管内皮细胞等血管特征细胞进行转基因标记，实现对于血管特征细胞的标记。例如在血管内皮细胞特异性表达的cd31基因后嵌入荧光蛋白表达基因，从而实现cd31阳性表达细胞的荧光标记，因此实现血管内皮细胞、也即血管的荧光标记。

9、3.血管特异性结合的凝集素标记：如番茄凝集素等，可与血管内皮特异性结合，注射进行血管，循环待其与血管内皮细胞特异性结合，即可实现对于血管的标记。

10、4.荧光染料血管填充法：采用带有荧光基团的染料，通过对血管管腔内灌注的方式，使染料填充于血管内，从而实现血管的标记。

11、抗体标记，操作繁复，高昂造价，尤其透明化方法更加不适合使用操作繁复的标记方法，会大大增加整个标记和透明化时间，因为涉及到对更大更厚的组织进行标记，需要的抗体不仅仅是体积倍数的增加，需要的标记时间也不仅仅是几倍的增加，标记一个小鼠肾脏大小的组织，往往需要15天以上的抗体标记时间。转基因标记则涉及到更高的标记成本。凝集素法虽然可对血管进行特异性标记，且标记方法也较简单，但凝集素造价昂贵，进行全组织或动物全身标记，费用过高。血管荧光填充物标记方法，有多种可选血管填充物，我们对比了多种填充物，并区分分子量大小，配合不同的标记注射方法，试验了多种透明化方法，找到了对应不同脏器的最适合的标记物分子量和标记注射方法的组合的新方法。

12、可兼容组织透明化的淋巴标记方法有两大类：

13、1.抗体标记法：淋巴标记可以选择的靶蛋白很多，例如prox-1(转录因子)、podoplanin、lyve-1、vegfr3、macrophage mannose receptor-1(巨噬细胞甘露糖受体-1)、ccl21(淋巴因子，可以吸引表达ccr7的细胞)、desmoplakin、plakoglobin(血小板珠蛋白)和integrinα9(整合素α9)。

14、2.标记物末梢外注射后渗透：此法利用淋巴管的收集特性，使标记物通过渗透被收集进入淋巴管从而对淋巴管进行标记，标记较为特异性且操作较为简便。

15、抗体标记意味着繁复的操作过程和高昂的造价；透明化后的组织抗体标记，需要更长时间和更大体积的抗体孵育，且成功率并不高；再者，虽然拥有众多可选靶蛋白，但这些靶蛋白并不具有绝对的淋巴管特异性。因此，本技术通过标记物末梢外注射后渗透方法叠加组织透明化的标记方法，并且细化标记物，标记物分子量，提出一种稳定可靠的快速标记小鼠多脏器淋巴管并能够经过透明化处理且荧光信号得到很好保留的新方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种快速标记小鼠多脏器血管和淋巴管并透明化的新方法，通过对血管及淋巴管使用填充类的荧光染料，快速有效标记小鼠血管和淋巴管，并且标记后的组织经过透明化后靶标信号仍然保留，且标记保持明亮，可靠性高；通过本方法标记血管和淋巴管后的组织，在透明化后能够完整的展示一定厚度的组织结构、组织内血管和淋巴管，为组织、器官甚至整个动物体的研究提供更丰富和更完整的信息。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明提供了一种快速标记小鼠多脏器血管和淋巴管并透明化的新方法，包括以下步骤：

4、s1、血管标记：采用荧光染料a以填充标记的方式对待检测生物组织血管进行注射标记；

5、s2、淋巴管标记：采用荧光染料b作为淋巴管标记物，经末梢外吸收，对淋巴管进行填充式标记；

6、s3、包含血管和淋巴管的组织透明化处理：

7、s3-1、预处理：将标记血管和淋巴管后的脏器组织浸泡在固定液中，以4℃的温度固定，完全固定后低温清洗去除固定液；针对没有光片显微镜的实验室，设计了将整个组织均分成多份厚度为1mm的薄片，可按需扫描观察连续组织薄片；

8、s3-2、脱脂脱色处理：将清洗后的脏器组织浸泡在透明化试剂中，放于摇床上，调整转速,在考虑试剂特性和工作效率的前提下，降低透明化浸泡温度、提高试剂更换次数；

9、s3-3、折射率匹配：将浸泡透明化试剂后的脏器组织放入折射率匹配试剂中，放于摇床上，调整转速,在考虑试剂特性和工作效率的前提下，降低浸泡温度、提高试剂更换次数；

10、s4、将填充和\或标记后的血管或淋巴管，用共聚焦、光片显微镜和\或无标记成像系统进行结果拍摄，成像并分析。

11、进一步，步骤s1中，使用荧光染料a对不同脏器血管采用尾静脉注射或心内注射，通过填充的方式标记血管。

12、在步骤s1和步骤s2中，血管标记物注射后，再进行淋巴管标记；血管标记时间不超过一小时，淋巴管标记时间不超过半小时。

13、进一步，步骤s3-1中，根据脏器组织的大小，调整固定时间，在低温情况下减少填充染料的弥散、降低填充型染料荧光的淬灭，或添加抗荧光淬灭试剂。

14、进一步，步骤s3-2和步骤s3-3中，针对经过对血管和淋巴管进行填充式荧光染料标记的组织，根据组织的大小，调整透明化的试剂浸泡时间，结合调整摇床转速及温控，达到最佳的透明效果和最少的荧光染料的泄露和荧光的淬灭。

15、进一步，所述荧光染料a葡聚糖-fitc、葡聚糖-tritc或伊文氏蓝；所述荧光染料b为葡聚糖-fitc、葡聚糖-tritc或伊文氏蓝。

16、进一步，s3-1中，步骤s3-3中，折射率匹配试剂由45克安替比林，30克烟酰胺，0.5毫升n-n-丁基二乙醇胺，加双蒸水配置而成；步骤s3-1中，固定液为4％多聚甲醛。

17、与现有技术相比，本方案的有益效果：

18、1.本发明对血管和淋巴管使用快速的填充方式标记，能够完成整个小鼠的快速的血管和淋巴管信息的获得。

19、2.本发明首先标记血管，稍待一段时间后，再通过末梢外注射填充标记淋巴管，这样可以完成淋巴管和血管的同时标记。

20、3.通过动物活体的血液和淋巴液不同的循环特点，可以对组织的血管和淋巴管分别进行充分、快速、可区分的标记，标记效果超过通过抗体标记效果。

21、4.将标记好的小鼠组织样品再经过透明化处理，可以得到比较完整的脏器的血管和淋巴管的分布。

22、5.通过血管标记和淋巴管和透明化的组织，经过共聚焦显微镜、光片显微镜、无标记显微镜、拉曼光谱成像显微镜等设备采集数据结果，再经过惠更斯软件，imaris软件等数据分析可以得到丰富的血管和淋巴管的位置、走向、密度、结构以及更多的可被分析解读的数据。

23、6.针对不同的脏器，不同的病理情况下的组织特点选择最佳的血管和淋巴管填充荧光染料的分子大小，最终可以得到明亮的、标记准确的、标记更密集，且可能标识病理状态的信息。

24、7.通过针对被标记的血管和淋巴管中在透明化之前填充的荧光染料，调整透明化方法，最终得到，最少荧光淬灭，最少荧光染料渗漏的标记结果。对应的标记血管和淋巴管，信号强，信噪比高。

25、8.组织血管标记，由于血液中的染料最终会通过肾脏代谢排出体外，所以，血管标记时间不可过久；利用淋巴管对大分子的吸收的作用通过对淋巴管进行特异性的标记；使用较大分子量的荧光染料，经末梢吸收标记淋巴管；由于最终淋巴液会通过静脉汇聚到血管中，所以，淋巴管标记时间不可过久；由于淋巴管吸收大分子比静脉注射标记慢，所以需要给与淋巴管标记充分的时间；血液循环不会进入淋巴管，故血管标记不会影响淋巴管标记；但若血液循环时间过长，标记物会进入肾脏代谢，故血管标记时间不可过长。

26、9.对于先通过荧光染料填充方式标记过的组织，透明化处理时需要采取措施保证：荧光基团不被淬灭；荧光染料不过度渗漏。而因此采取，例如低温固定，低温保护荧光基团不淬灭；通过增加透明化试剂的浸泡量，在摇床上摇动的方式，加快透明化操作，从而缩短浸泡在透明化试剂中的时间等方法来保护被标记目标的荧光信号。

27、10.对组织中的血管，淋巴管标记后，再透明化可以获取更多更丰富的信息。这些信息可以用共聚焦显微镜拍摄获得，也可以用光片显微镜拍摄获得，或者结合二次谐波成像，拉曼成像等多种成像方式，得到更为丰富的图像及数据信息，再结合图像分析软件及其他分析软件，抽提数据，建立对于血管与淋巴管再透明化后，采集到数据的数据分析方法。