井冈霉醇胺的直接生物合成方法

本发明涉及酶学和基因工程，涉及一种井冈霉醇胺的直接生物合成方法。

背景技术：

1、井冈霉醇胺(valiolamine)属于氨基环醇类化合物，化学名是(is)-(1(羟基)，2,4,5/1,3)-5-氨基1-碳-羟甲基-1,2,3,4-环己烷四醇，具有很强的α-d-葡萄糖苷酶抑制活性，是假氨基糖类水解酶抑制剂的核心结构(j.antibiot.,1984,37,1301-1307)。井冈霉醇胺及其衍生物不仅可以参与治疗与糖苷酶相关的疾病，如糖尿病等，还可作为癌症、艾滋病及相关综合症的治疗(kajimoto t,node m.inhibitors against glycosidases asmedicines.current topics in medicinal chemistry,2009,9(1):13-33.)。含有井冈霉醇胺结构的抗ii型糖尿病药物伏格列波糖(贝欣)是典型的糖苷酶抑制剂类降糖药物(kataoka y,yasuda s,miyamoto y,sase k,kosuge m,kimura k,yoshimasa y,miyazakis.effects of voglibose and nateglinide on glycemic status and coronaryatherosclerosis in early-stage diabetic patients.circulation journal,2012,76(3):712-720.)，具有降血糖性能好、副作用小的优点，作为国家基本药物在临床上广为使用。井冈霉醇胺是伏格列波糖合成的直接前体，建立有效的井冈霉醇胺合成途径，能有效增加抗糖尿病药物的市场供应，降低伏格列波糖的生产成本，减轻长期用药病人的负担，提高糖尿病人的生活质量，对井冈霉醇胺的合成途径的研究得到学术界的高度关注。

2、目前国内外报道的井冈霉醇胺的生产方法主要有两类，即以井冈霉烯胺为前体的化学全合成的方法和基于生物合成基础上的化学合成方法(半生物合成方法)。化学合成法(chang yk,lo hj,yan th.aflexible strategy based on a c2-symmetric pool ofchiral substrates:concise synthesis of(+)-valienamine,key intermediate of(+)-pancratistatin,and conduramines a-1and e.organic letters,2009,11(19):4278-4281)路线长，从而导致总收率较低，成本较高，规模生产后产品的竞争力较差，产业化价值不高。目前主要采用半生物合成技术来制备井冈霉醇胺，即利用微生物吸水链霉菌发酵制备井冈霉素，再经脱氮假单胞杆菌酶解转化得到关键中间体—井冈霉烯胺(kameda y,horri s,yamino t.microbial degradation of validamycin aby flavobacteriumsaccharophilum.enzymatic cleavage of c-n linkage in validoxylamine a.thejournal of antibiotics,1984,37(8):859-867.zhang jf,zheng yg,shenyc.preparation of 3-ketovalidoxylamine a c-n lyase substrate:n-p-nitrophenyl-3-ketovalidamine by stenotrophomonas maltrophilia cctcc m 204024.appliedmicrobiology and biotechnology,2007,73(6):1275-1281.)，随后通过5-9步化学反应合成井冈霉醇胺(horii,satoshi,hiroshi fukase,yukihiko kameda.(1985)stereoselective conversion of valienamine and validamine into valiolamine,carbohydr res 140(2),185-200，专利jp57179174,cn1683320,jp58046044)。井冈霉醇胺合成需要经过两步微生物发酵和多步骤化学反应的偶联，存在工艺复杂、条件苛刻、步骤繁琐、监控点多、收率低等缺点，生产效率亟待提高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供全新设计从头合成井冈霉醇胺的生物制备方法，以解决现有技术中所存在的手性构建步骤繁琐、效率低、调控复杂等问题。具体而言，本发明采用微生物主代谢途径的7-磷酸景天庚酮糖为底物，在环化酶、异构酶和转氨酶的依次催化下，经环化、异构和转氨三个反应步骤，催化生成井冈霉醇胺。就方法而言，本发明提供的多酶催化7-磷酸景天庚酮糖生物制备井冈霉醇胺的方法步骤简单、结构明确、操作可控，使复杂的化学反应和交错微生物代谢过程缩减为简单的生物转化途径，从根本上克服了化学反应步骤多、效率低、有机溶剂污染并缩减了两步微生物发酵过程繁琐的操作及复杂的调控步骤。

2、本发明的目的可以通过以下方案来实现：

3、第一方面，本发明提供一种井冈霉醇胺的直接生物合成方法，以式ii所示的7-磷酸景天庚酮糖为底物与辅因子、氨基供体，在环化酶、异构酶和转氨酶的依次催化下，经生物化学反应最终生成式i所示的井冈霉醇胺；

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5、作为本发明的一个实施方案，所述直接生物合成方法的反应路线如下：

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7、作为本发明的一个实施方案，所述的直接生物合成方法的具体包括如下操作：将7-磷酸景天庚酮糖、环化酶、异构酶、转氨酶、辅因子和氨基供体进行多酶催化反应，(采用分步或者多酶协同催化)产生井冈霉醇胺。

8、进一步地，所述多酶催化反应在ph为7-7.4的缓冲液中，25～37℃下进行。

9、进一步地，1mg/ml环化酶在1mm辅因子的存在下，可催化2-3mm 7-磷酸景天庚酮糖反应；1mg/ml异构酶在1mm辅因子的存在下，可催化2-3mm 2-epi-井冈霉醇酮反应；1mg/ml转氨酶在0.5mm辅因子的存在下，可催化5mm井冈霉醇酮和5-8mm氨基供体之间的转氨反应。

10、作为本发明的一个实施方案，环化酶和异构酶的辅因子包括nad+、nadp+、co2+、维生素b12中的一种或多种。nad+属于通用型辅因子，为金属依赖型的酶，需要co2+或维生素b12提供的co2+，起电子传递作用。

11、作为本发明的一个实施方案，转氨酶的辅因子包括磷酸吡哆醛(plp)，转氨酶的氨基供体包括l-谷氨酰胺，l-谷氨酸盐中的一种或多种。井冈霉醇酮接受氨基供体经辅因子传递来的氨基，生成井冈霉醇胺。

12、作为本发明的一个实施方案，所述环化酶来源于磷酸糖环化酶超家族evs和eevs家族；异构酶来源于邻近氧螯合家族(vicinal oxygen chelate,voc)；转氨酶来源于天冬氨酸氨基转移酶i家族、degt_dnrj_erycii_strc氨基转移酶亚家族。

13、作为本发明的一个实施方案，所述环化酶为负责催化7-磷酸景天庚酮糖环化生成2-epi-井冈霉醇酮的环化酶，以及运用蛋白质技术手段对环化酶改造形成的突变体中的一种或多种。所述环化酶包括氨基酸序列依次如seq id no.1-4所示的amir_2000、staur_3140、vala、acbc环化酶中的一种或多种。

14、作为本发明的一个实施方案，所述异构酶为负责催化2-epi-井冈霉醇酮2-羟基异构的异构酶，以及运用蛋白质技术手段对异构酶改造的突变体中的一种或多种。所述异构酶包括氨基酸序列依次如seq id no.5-7所示的vald、cetb、acbo异构酶中的一种或多种。

15、作为本发明的一个实施方案，所述转氨酶为来自于抗生素结构中负责催化酮糖氨基化的转氨酶，以及运用蛋白质技术手段对转氨酶改造的突变体中的一种或多种。所述转氨酶包括氨基酸序列依次如seq id no.8-27所示的wece、btrr、arnb_eco、arnb_sty、desi、per_ccr、per_eco、pgle、psec、desv、megdii、tylb、qdtb、wbpe、rffa、gtmb、rbmb、stsc、spcs2、tbmb转氨酶中的一种或多种。

16、第二方面，本发明还提供一种井冈霉醇胺的直接生物合成方法，以7-磷酸景天庚酮糖供应菌株为底盘微生物，引入环化酶、异构酶和转氨酶基因，采用所获得的基因工程菌通过发酵产生井冈霉醇胺。

17、作为本发明的一个实施方案，所述引入的方法为采用crispr-cas9基因操作系统，将环化酶、异构酶、转氨酶的表达基因整合到7-磷酸景天庚酮糖供应菌株的基因组上，得到直接生物合成井冈霉醇胺的基因工程菌。

18、作为本发明的一个实施方案，所述7-磷酸景天庚酮糖供应菌株包括天然菌株及在其基础上采用生物工程手段改造的突变菌株。

19、进一步地，天然菌株包括大肠杆菌、酵母及放线菌中的一种。

20、在一些优选实施例中，所述7-磷酸景天庚酮糖供应菌株为大肠杆菌mg1655。

21、本发明通过环化酶、异构酶和氨基转移酶与氨基供体、辅因子存在的体外多酶催化反应，或将环化酶、异构酶和转氨酶基因引入7-磷酸景天庚酮糖生物合成基因通路，构建7-磷酸景天庚酮糖经环化、异构、转氨反应，提供井冈霉醇胺生物合成途径。

22、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

23、1、本发明创新了采用合成生物学超天然设计理念，依据目标产物和出发底物结构和反应特征，从头设计了从糖代谢磷酸戊糖通路中间产物7-磷酸景天庚酮糖经环化酶生成2-epi-井冈霉醇酮、异构酶将2-epi-井冈霉醇酮转化为井冈霉醇酮、再用转氨酶将井冈霉醇酮转化为井冈霉醇胺的人工途径生物合成途径，建立了井冈霉醇胺直接生物合成的技术方案，解决了常规井冈霉醇胺制备方法中低选择性催化剂所导致的手性中心构筑困难的缺陷。

24、2、本发明设计途径的第二步异构反应和第三步转氨反应为人工设计反应，尚未有酶可催化该反应步骤的报道。本发明创造性采用cetb、vald等异构酶用于2-epi-井冈霉醇酮结构上羟基的异构化，生成井冈霉醇酮；同时创造性将wece等转氨酶用于井冈霉醇酮合成井冈霉醇胺，属于突破天然酶催化底物的创造性拓展。

25、3、本发明合成方法缩减了现有两步微生物发酵过程加5步化学催化反应组合的繁琐操作及复杂的调控步骤，大幅提高了生产效率及收率。

26、4、本发明基于由环化酶、异构酶和氨基转移酶催化的生物反应，建立方便、高效、立体选择性强的井冈霉醇胺直接生物合成策略，为ii型糖尿病临床药物伏格列波糖、阿卡波糖的合成及糖苷酶功能异常引起的相关疾病的药物开发提供直接的药物先导化合物。