基于微流控芯片的环形荧光探针介导的等温扩增体系、试剂盒及应用

本发明涉及基于微流控芯片的环形荧光探针介导的等温扩增体系、试剂盒及应用。属于食源性致病菌的快速检测。

背景技术：

1、目前用于检测副溶血性弧菌的检测方法，如微生物培养法、免疫学方法、聚合酶链式反应、环介导等温扩增等方法，其中微生物培养法是定为国家标准的方法，该方法检测准确，但过程繁琐，检测时间过长；免疫学方法具有较高的灵敏度，但抗原和抗体的结合存在交叉反应导致假阳性的问题；聚合酶链式反应灵敏度高、可在几小时内完成检测，但该方法需要复杂的变温过程，控温精准的仪器设备和熟练的操作人员，从而检测场地受到限制；环介导等温扩增方法反应迅速，操作简单，但易发生非特异性扩增从而产生假阳性信号。

2、专利cn117568500b公开了一种水产品中病原菌的双重pcr检测试剂盒，以副溶血性弧菌的tlh基因和无乳链球菌的sip基因为靶标构建双重pcr检测试剂盒用于检测水产品中的病原菌。该专利技术可在单管同步检测，实现可同时鉴别副溶血性弧菌和无乳链球菌两种病原菌，具有灵敏度高，特异性强、操作简便的特点，解决了单次快速有效检测两种病原菌的问题。但该技术检测扩增产物的方式为琼脂糖凝胶电泳，这将使检测时间延长，检测地点受限，而无法用于现场快速检测。

3、专利申请cn115725762a公开了一种用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂，以副溶血性弧菌的toxr基因和创伤弧菌的rpos基因为靶标，构建基于lamp方法的可视化半定量检测方法用于低成本、快速检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌。该专利申请的体系引入聚乙二醇提高aunps的稳定性，在不同菌浓度下aunps团聚程度不同而呈现出颜色的区别。但该技术容易发生非特异性扩增，从而产生假阳性信号。

4、专利cn116732204b公开了同时检测多种病原的多重lamp引物组、检测方法和试剂盒，以哈维氏弧菌的toic基因、副溶血弧菌的dnaj基因及石斑鱼虹彩病毒的rad2基因为靶基因构建多重lamp方法用于检测样品中是否感染哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒。该专利技术的扩增产物的检测方式为钙黄绿素显色法和凝胶电泳分析，这两种方法容易发生非特异性扩增，从而产生假阳性信号。

技术实现思路

1、本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，本发明提供基于微流控芯片的环形荧光探针介导的等温扩增体系、试剂盒及应用。

2、为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

3、1、基于微流控芯片的环形荧光探针介导的等温扩增体系，包含微流控芯片以及预埋于微流控芯片上的环形荧光探针组合，所述的环形荧光探针组合由三对靶标分别为副溶血性弧菌toxr、tlh、tdh基因的环形荧光探针(cfp)组成。

4、作为优选的技术方案之一，所述微流控芯片为4样本微流控芯片，即每个样品孔对应着8个反应孔。

5、作为优选的技术方案之一，所述微流控芯片(尺寸约为81mm)是由聚碳酸酯(pc)通过微注射成型工艺制成的cd形芯片，如图1所示，由中心至外侧分别为加样区，微米级通道和反应区组成。本发明采用离心式4样本微流控芯片，即每个加样孔对应着8个反应孔。

6、作为优选的技术方案之一，所述的环形荧光探针组合具体如下：

7、靶标为副溶血性弧菌toxr基因的环形荧光探针：

8、正向cfp-toxr：fam-caggttct/itamdt/caacttcaattgagctttgtactgttgaacgcc，如seq id no.1所示；

9、反向cfp-toxr：fam-tctgataacaa/itamdt/gacgcctctggaagacgtcgctaaaga，如seqid no.2所示；

10、靶标为副溶血性弧菌tlh基因的环形荧光探针：

11、正向cfp-tlh：fam-cgcgt/itamdt/cacgaaaccgtgctgatactcacgccttgttcga，如seqid no.3所示；

12、反向cfp-tlh：fam-ttggaca/itamdt/caaccgctcatcgtgacgctgcacactcagag，如seqid no.4所示；

13、靶标为副溶血性弧菌tdh基因的环形荧光探针：

14、正向cfp-tdh：fam-tgacgttg/itamdt/gaatactgattgaccggtctctgacttttggaca，如seq id no.5所示；

15、反向cfp-tdh：fam-tggttgaca/itamdt/cctacatgactgatgaccgctcttatagcc，如seqid no.6所示。

16、作为优选的技术方案之一，使用primerexplorer在线设计工具设计出符合探针要求的多组fip/bip。尽量选择在不同区域进行引物设计，通过试验筛选出最佳引物组。筛选最优引物组的方法是在cfpa反应体系中再加入syto-9和靶标质粒dna。筛选出的最优引物需将其5’端标记fam绿色荧光基团，其5’端10nt附近t碱基标记猝灭基团tamra。

17、作为优选的技术方案之一，在微流控芯片上分别预埋1.5μl含有0.1％(w/v)海藻糖的不同靶标的cfp和水，37℃恒温干燥1小时，密封透明底膜并于-20℃保存。

18、作为优选的技术方案之一，所述等温扩增体系为5μl，包括：1×等温扩增缓冲液，6mm mgso4，1.4mm dntp(脱氧核酸核苷三磷酸)，4u bst dna聚合酶，0.6u fen1酶，2.5％(w/v)bsa(牛血清白蛋白)，0.5μl dna模板，用无菌超纯水补足体积。

19、作为优选的技术方案之一，所述等温扩增体系的反应条件为：63℃反应60分钟，使用微流控恒温扩增检测仪检测荧光信号。

20、2、前述等温扩增体系在制备副溶血性弧菌检测试剂盒中的应用。

21、作为优选的技术方案之一，所述试剂盒用于副溶血性弧菌污染对虾的检测。

22、3、一种副溶血性弧菌检测试剂盒，包含前述等温扩增体系。

23、本发明的有益效果：

24、为进一步提高方法的特异性，本技术基于微流控芯片的优势，构建微流控-环形荧光探针介导的等温扩增多靶标检测方法，以toxr，tlh和tdh为靶标基因，从而实现在单芯片上同时检测三个靶标基因，检测对虾中的副溶血性弧菌，在食源性致病菌快速检测领域具有非常好的应用前景。

25、本发明的试验原理如下：

26、本发明将环形荧光探针介导的新型等温扩增(cfpa)方法与4样本离心式微流控芯片结合，以副溶血性弧菌的两种毒力因子(tlh和tdh)，一种毒力基因调控因子(toxr)为靶标基因，用于多靶标、高灵敏、高特异性检测对虾中的副溶血性弧菌。本发明能够在单芯片上同时检测4样本中是否存在toxr，tlh和tdh基因，其反应原理是在bst dna聚合酶的作用下，正向环形荧光探针(cfp)与靶标结合并不断延伸形成单茎环结构，反向cfp与单茎环结构的3’端结合并延伸，在靠近茎环结构附近形成重叠分叉结构，借助fen1酶识别特定结构，从而剪切5’端荧光基团，从而检测到特异性的荧光信号。

27、本发明通过筛选获得针对毒力基因的调控因子(toxr)，不耐热溶血素(tlh)和耐热性直接溶血素(tdh)的编码基因的环形荧光探针，实现多靶标、高特异性、快速检测致病性副溶血性弧菌。与现有的检测方法相比，本发明将微流控芯片与环形荧光探针介导的新型等温扩增方法结合，用高特异性环形荧光探针作为靶标dna的标记，通过剪切荧光探针5’端荧光基团读取荧光信号，实现在单芯片上同时检测副溶血性弧菌毒力基因的调控因子(toxr)，不耐热溶血素(tlh)和耐热性直接溶血素(tdh)的编码基因。本发明具有高灵敏度、高特异性和良好的稳定性(c.v.＜5％)。

28、本发明具有以下优势：

29、1、本发明可用于快速、高灵敏、高特异性检测对虾中的副溶血性弧菌，无需对样品进行预富集即可检测。

30、2、本发明操作简便，可实现多靶标、高通量检测副溶血性弧菌，不需要专业的操作人员，降低检测成本，提高检测效率。

31、3、本发明具有良好的灵敏度和高特异性，且无需复杂的变温过程。

32、4、本发明将环形荧光探针介导的新型等温扩增方法与微流控芯片进行结合，构建微流控-cfpa方法用于检测对虾中副溶血性弧菌。

33、本发明借助环形荧光探针对靶标dna进行特异性标记，解决常规等温核酸扩增方法中容易出现非特异性扩增、产生假阳性信号等问题；借助微流控芯片实现多通道现场检测，解决现有方法受场地限制、无法现场快速检测的局限性。

34、5、本发明所采用的微流控芯片是离心式微流控芯片，检测的样本更多。