一种电泳联合HHRZ快速测定mRNApolyA尾长度的方法与流程

本发明属于生物。更具体地，涉及一种电泳联合hhrz快速测定mrnapolya尾长度的方法。

背景技术：

1、信使rna (mrna)于20世纪60年代首次被科研人员发现，现已成为倍受瞩目的基础学科和应用研究领域。mrna被认为是在生命器官中调节基因功能的多功能分子，基于此出现许多不同类型的mrna疗法，例如mrna疫苗。mrna新冠疫苗其安全性和有效性得到了广泛验证，也证明了新一代mrna疗法的潜力。

2、在制备mrna疫苗技术中，由于mrna 3’端的polya尾可以保护mrna不被降解，增加mrna的稳定性，提高翻译效率，从而让mrna稳定发挥疗效。mrna polya尾存在易降解的问题，因此开发对mrna polya尾进行检测具有重要意义。而目前对体外转录合成的mrna原料的一系列质量测试主要包括mrna浓度及纯度、mrna序列完整性、表达能力及安全性等，少有对mrna polya尾长度的检测方法的研究。

3、传统mrna polya尾的检测方法主要是利用经典的rnase t1酶，以g残基为酶切位点，特异性降解mrna，进而获得含有polya尾的mrna片段，再用oligo dt磁珠富集技术，对含有polya尾的mrna片段进行富集纯化，利用lc-ms对其进行检测得到polya尾长度信息。另有中国发明专利申请cn116926163a披露了一种基于脱氧核酶的完整测定mrna polya尾的方法，以脱氧核酶在mrna的特定位点进行特异性酶切(gc，gu，ac，au或au，ac，ag，uc，ug，cg酶切位点)，产生具有完整长度的polya片段后，同样利用o1igodt磁珠富集纯化后再利用lc-ms对富集纯化所得的具有完整长度的polya片段进行检测。但是，上述检测方法不仅需要对酶切片段进行o1igodt磁珠富集纯化，更重要的是依赖于lc-ms技术，实验周期长且检测成本很高。

4、目前缺乏快速、低成本的测定mrna polya尾长度的方法。

技术实现思路

1、本发明旨在克服现有mrna polya尾长度的检测方法周期长且检测成本高的问题，提供一种低成本的快速测定mrna polya尾长度的方法。本发明探索出了电泳联合hhrz快速测定mrna polya尾长度的方法，不依赖复杂技术体系、不依赖大型或昂贵仪器，且准确性能与lc-ms法相当。

2、本发明的目的是提供一种电泳联合hhrz快速测定mrna polya尾长度的方法及其应用。

3、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

4、针对现有mrna polya尾长度检测技术周期长且检测成本高的问题，发明人首先尝试对检测技术中的各环节进行低成本替代，意外想到可否采用普通的极低成本的电泳来替代lc-ms进行polya片段长度的判断呢？以及以成本低、常见的rna片段纯化技术(如市售rna纯化试剂盒)替代o1igodt磁珠富集纯化技术？但是实验结果显示，无法有效跑出条带。进而发明人团队进行了研究摸索，寻找原因，经过不断地尝试，意识到可能是酶切的问题。我们发现，o1igodt磁珠富集纯化技术能够特异性回收polya片段，而常规的rna纯化试剂盒没有特异性，无法实现polya片段的特异性富集，而普通电泳技术的灵敏度是有限的，因此在酶切效率不高的情况下自然无法跑出条带。至此，发明人团队继续探索针对mrna polya尾的高效酶切技术，研究得到采用锤头型核酶(hhrz)在特定酶切位点的高效酶切方法，酶切产物可采用低成本的rna纯化试剂盒纯化结合普通电泳技术即可得到polya尾长度信息。

5、具体地，本发明提供了一种电泳联合hhrz快速测定mrna polya尾长度的方法，使用锤头型核酶对待检测mrna进行酶切，对酶切产物进行纯化回收，然后进行电泳检测，得到polya尾长度信息。

6、优选地，所述锤头型核酶的酶切位点为guc、auc、gua、aua或cuc。

7、更优选地，所述锤头型核酶的酶切位点为guc。

8、所述待检测mrna为含有guc、auc、gua、aua或cuc位点的mrna。

9、作为可选择的实施方案，所述酶切位点在polya尾上游20～500nt内。

10、作为可选择的实施方案，所述酶切位点在polya尾上游20nt内。

11、优选地，所述锤头型核酶的完整序列由左同源臂序列、核心序列和右同源臂序列组成；所述核心序列如seq id no.1所示。

12、具体地，左同源臂序列和右同源臂序列根据与待检测mrna碱基互补配对进行设计。

13、优选地，左同源臂序列和右同源臂序列长度为8-15个核苷酸。

14、优选地，所述酶切的体系为100～300mm tris-hcl缓冲液1～3μl、5～10μm锤头型核酶1～3μl、1～3μg mrna。

15、优选地，所述酶切的体系中加入终浓度为1～1.25mm的mg离子。

16、作为可选择的实施方案，所述mg离子由mgcl2提供。

17、优选地，所述电泳为毛细管电泳(ce电泳)、尿素-page电泳或琼脂糖凝胶电泳。

18、更优选地，所述电泳为尿素-page电泳或毛细管电泳。

19、作为可选择的实施方案，酶切产物进行ce电泳，通过已知大小的ladder确定目标峰的大小和数量，同时计算目标峰面积，以分析mrna polya尾的不同长度分布及比例。

20、作为可选择的实施方案，所述琼脂糖凝胶电泳的条件为电压100-150v运行30～40min；尿素-page电泳的条件为电压200v运行60～70min。

21、作为可选择的实施方案，所述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶浓度为1～4％；所述尿素-page电泳的page胶浓度为12～20％。

22、作为可选择的实施方案，所述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶浓度为3％；所述尿素-page电泳的page胶浓度为12％。

23、优选地，所述纯化回收的方法为通过rna纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收，或者通过氯化锂沉淀法对酶切产物进行纯化回收。

24、作为可选择的实施方案，酶切的方法包括如下步骤：

25、s1.配制酶切体系，酶切体系在93～98℃反应1～3min，室温孵育2～8min；

26、s2.向酶切体系加入1μl 20～25mm mgcl2，在37～45℃孵育60～120min。

27、优选地，酶切的方法包括如下步骤：

28、s1.配制酶切体系，酶切体系在95℃反应2min，室温孵育5min；

29、s2.向酶切体系加入1μl 20mm mgcl2，在37℃孵育60min。

30、另外，基于上述研究成果，上述锤头型核酶在检测mrna polya尾长度中的应用，以及上述方法在检测mrna polya尾长度中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

31、本发明具有以下有益效果：

32、本发明提供了一种电泳联合hhrz快速测定mrna polya尾长度的方法，本发明通过实验研究设计出用于mrna polya尾酶切的锤头型核酶及特定酶切位点方案，酶切产物经纯化后通过琼脂糖凝胶电泳、尿素-page电泳或毛细管电泳等普通电泳技术即可对mrnapolya尾长度进行分析。与传统mrna polya尾检测方法比较，该方法所需时间和成本均大幅度减少，不依赖复杂技术体系、不依赖大型或昂贵仪器，且准确性能与lc-ms相当，可实现快速便捷、低成本、准确检测mrna polya尾长度的目的，并且本发明酶切电泳检测mrna polya尾长度的方法酶切效率极高，检测所需的rna用量很少，具有很好的应用价值。