一种细胞因子活菌佐剂及其在增强鸡艾美耳球虫活疫苗免疫效果中的应用

本发明涉及疫苗佐剂，更具体的说是涉及一种细胞因子活菌佐剂及其在增强鸡艾美耳球虫活疫苗免疫效果中的应用。

背景技术：

1、鸡球虫病是一种主要侵害鸡肠道上皮细胞的危害极其严重的全球性寄生原虫病，给养禽业常带来巨大经济损失。柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫是目前流行最广及致病性较强的三种球虫。国内外球虫学专家普遍认为，未来球虫病的防控策略总体上将以“免疫预防为主，药物治疗为辅”，疫苗接种是防制本病的主要手段。鸡球虫病活苗是实际生产中唯一可替代抗球虫药物以控制球虫病的方法，其中早熟弱毒株是全世界公认的免疫原性好、致病力低、遗传稳定的鸡球虫病疫苗虫株。但鸡球虫病早熟弱毒株疫苗依然存在免疫产生期长、影响雏鸡增重等缺陷。

2、鸡白介素2(chil-2)是鸡白介素家族中研究最早、且最为深入的细胞因子。因其有着强大的t细胞增殖作用而备受关注，在疾病治疗和佐剂研究领域居于主导地位。鸡白介素4(chil-4)发现较晚，其主要功能是促进体内b细胞的增殖活化，作为一种b细胞生长因子促进体内的体液免疫应答反应。有试验表明在对抗寄生虫感染的特异性免疫反应中，chil-4和chil-2起到至关重要的作用。

3、融合基因佐剂pci-chil-4-chil-2-egfp配合疫苗进免疫虽然可加强鸡的全面免疫应答能力，缩短免疫空窗期，使得疫苗发挥更加高效稳定的免疫效果。融合基因佐剂pci-chil-4-chil-2-egfp因含耐药基因存在着潜在的风险，同时也存在生产成本较高、肌注给药不太方便之不足。为此，研究者致力于研究安全性更高，生产成本更低，可口服给药的的新型食品级重组乳酸菌佐剂。

4、乳酸乳球菌(lactococcus lactis，l.lactis)作为乳酸菌的模式菌株，遗传背景清楚且具有较多基因工程的工具，以其作为宿主菌表达投递外源蛋白的研究居多。l.lactis不产荚膜和芽孢，2011年我国卫生部将其列入《可用于食品的菌种名单》。l.lactis nz3900/pnz8149不存在任何抗性基因，以lacf基因(乳糖操纵子)作为筛选标记；诱导剂为无毒无害的nisin，整个表达系统也均不涉及抗生素，生物安全性高。

5、因此，提供一种细胞因子活菌佐剂及其在增强鸡艾美耳球虫活疫苗免疫效果中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种细胞因子活菌佐剂及其在增强鸡艾美耳球虫活疫苗免疫效果中的应用。

2、本发明以食品级lactococcus lactis表达系统作为载体，表达具有生物活性的融合细胞因子，作为配合鸡球虫病三价四株活疫苗使用的食品级佐剂。具体以融合鸡白细胞介素4(chil-4)和鸡白细胞介素2(chil-2)为对象构建l.lactis nz3900/pnz8149-il-4-il-2(rlil4/2)，用于鸡球虫病三价四株活疫苗(1株柔嫩艾美耳球虫、1株堆型艾美耳球虫、2株巨型艾美耳球虫)的细胞因子活菌佐剂。本发明构建的重组菌rlil4/2能够表达和分泌chil-4-chil-2，体外可促进鸡脾脏淋巴细胞增殖；体内可在鸡肠道定植7天，促进肠道菌群有益菌增殖和减少有害菌。rlil4/2与鸡球虫病三价四株活疫苗同时免疫具有良好的的佐剂效果(对鸡球虫病三价四株活疫苗具有增效作用)，减少免疫产生期、疫苗使用剂量及疫苗对雏鸡增重的不良影响。

3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种重组表达载体，含有chil-4-linker-chil-2融合基因；所述chil-4-linker-chil-2融合基因的基因序列如seq id no.1所示所示。

5、进一步，所述表达载体为pnz8149。

6、进一步，一种细胞因子活菌佐剂，含有所述的重组表达载体。

7、进一步，所述的一种细胞因子活菌佐剂的制备方法，具体步骤如下：

8、(1)将chil-4-linker-chil-2融合基因与表达载体pnz8149进行连接；

9、(2)连接产物转化l.lactis nz3900，得到细胞因子活菌佐剂rlil4/2。

10、用于鸡球虫病三价四株活疫苗的细胞因子活菌佐剂rlil4/2的构建方法，将chil-4-chil-2融合基因序列连入pnz8149载体，电转化入l.lactis nz3900，在选择培养基上培养得到阳性克隆子，采用pcr、双酶切和高通量测序等技术鉴定重组菌载体，获得chil-2-chil-4融合基因的细胞因子活菌佐剂rlil4/2。构建的细胞因子活菌佐剂rlil4/2经nisin诱导后可分泌表达chil-4、chil-2，分别促进鸡脾脏t、b淋巴细胞增殖。

11、进一步，所述的一种细胞因子活菌佐剂或所述的制备方法制备得到的细胞因子活菌佐剂在增强鸡艾美耳球虫活疫苗免疫效果中的应用。

12、进一步，所述的一种细胞因子活菌佐剂或所述的制备方法制备得到的细胞因子活菌佐剂在降低鸡艾美耳球虫活疫苗副作用中的应用。

13、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种细胞因子活菌佐剂及其在增强鸡艾美耳球虫活疫苗免疫效果中的应用，具有以下有益效果：

14、本发明制备的细胞因子活菌佐剂rlil4/2与鸡球虫病三价四株活疫苗联用，用于鸡只球虫病(柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫)的免疫防控。其具体使用方法是进行鸡球虫病三价四株活疫苗滴口免疫的同时，口服重组乳酸菌rlil4/2计为107～1011cfu/只。优选的，口服剂量记为109cfu/只。

15、本发明制备的细胞因子活菌佐剂rlil4/2可以促进鸡脾脏淋巴细胞增殖，直接经口免疫对鸡球虫病三价四株活疫苗具有明显的增效作用，并可以消除该疫苗对雏鸡增重的不良影响。该佐剂具有更好的安全性，高效、易操作、廉价、易保存等优势。

技术特征：

1.一种重组表达载体，其特征在于，含有chil-4-linker-chil-2融合基因；所述chil-4-linker-chil-2融合基因的基因序列如seq id no.1所示所示。

2.根据权利要求1所述的一种重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pnz8149。

3.一种细胞因子活菌佐剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的一种细胞因子活菌佐剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

5.权利要求3所述的一种细胞因子活菌佐剂或权利要求4所述的制备方法制备得到的细胞因子活菌佐剂在增强鸡艾美耳球虫活疫苗免疫效果中的应用。

6.权利要求3所述的一种细胞因子活菌佐剂或权利要求4所述的制备方法制备得到的细胞因子活菌佐剂在降低鸡艾美耳球虫活疫苗副作用中的应用。

技术总结本发明公开了一种细胞因子活菌佐剂及其在增强鸡艾美耳球虫活疫苗免疫效果中的应用，属于疫苗佐剂技术领域。本发明公开的一种细胞因子活菌佐剂，由ChIL‑4和ChIL‑2融合基因为对象，连接在L.lactis NZ3900/pNZ8149表达系统上构建得到。本发明将细胞因子活菌佐剂RLIL4/2与鸡球虫病三价四株活疫苗联用，显著提高鸡球虫病三价四株活疫苗的免疫效果和降低其副作用，特别是对雏鸡增重和疫苗免疫剂量的影响。技术研发人员：张黎,郑龙龙,郑明学,霍乃蕊,谭凡,王礼铭,张红慧,张皓玉,陈莹莹受保护的技术使用者：山西农业大学技术研发日：技术公布日：2024/8/27