双特异性CD16A结合剂的制作方法

本发明涉及一种双特异性抗体构建体，其包含第一结合结构域(a)，其能够特异性结合第一靶标(a’)，所述第一靶标(a’)是免疫效应细胞表面上的cd16a；以及第二结合结构域(b)，其能够特异性结合第二靶标(b’)，所述第二靶标(b’)是靶细胞表面上的抗原。本发明还涉及相关的核酸分子、载体、宿主细胞、产生抗体构建体的方法、药物组合物、医学用途和试剂盒。

背景技术：

1、自然杀伤细胞是细胞毒性的，产生ifn-γ和tnf-α的先天淋巴样细胞被认为是针对病毒感染的细胞和癌细胞的第一道防线(cerwenka和lanier2001)。通过将nk细胞裂解重定向至肿瘤细胞并刺激在nk细胞表面上表达的活化受体cd16a(也称为fcγriiia)，nk细胞的细胞毒性潜力可以用于癌症免疫疗法中。nk细胞在其表面具有多种激活性和抑制性受体共同调节nk细胞的活化并触发效应子功能。这些受体中的几种对nk细胞介导的识别、杀伤癌细胞和细胞因子分泌发挥关键作用。cd16a活化促进nk细胞增殖和针对癌细胞的记忆样细胞毒性(pahl等2018cancer immunol res；6(5),517-27；doi:10.1158/2326-6066.cir-17-0550)。连接后，cd16a诱导有效的一系列信号，这些信号导致细胞因子产生和通过抗体依赖性细胞毒性(adcc)的细胞毒性效应子活性。在这方面，描述了识别肿瘤细胞表面上的肿瘤选择性抗原(例如cd20)的肿瘤特异性单克隆抗体(mab，比如利妥昔单抗)通过adcc诱导nk细胞介导的抗肿瘤活性(wang等，front.immunol.,2015,6:368,doi:10.3389/fimmu.2015.00368)。

2、然而，使用双或多特异性抗体指导nk细胞裂解肿瘤细胞被认为是有效的免疫治疗方法，并且提供了增加特异性、效力和利用新的作用机制的机会。已经开发了由结合cd16a的一个臂和结合肿瘤相关抗原(例如cd19)的另一个臂组成的双特异性抗体(kellner等2011 cancer lett.303(2):128-139)。wo 2006/125668和reusch等,mabs,2014,6:3:728-739描述了一种抗原结合蛋白—双特异性串联(tandam)双抗体—用于接合cd16a，及其用于自然杀伤(nk)细胞疗法的用途。通过经由与cd16a多价结合而增加亲合力，例如使用具有与cd16a的二价结合的构建体(wo2019/198051 affifmed gmbh)，nk细胞的细胞毒性活性可被增强。

3、活化nk细胞上活化诱导的cd16下调/脱落是由解整合素金属蛋白酶(adam17)(romee等，blood,2013,121(18):3599–3608)或膜型6基质金属蛋白酶(mmp25)(peruzi等，j.immunol.,2013,191:955-957)对其细胞外部分的蛋白水解切割引起的。然而，cd16脱落不会立即恢复，表明一旦nk细胞被活化且cd16被下调，nk细胞的adcc能力会受损几天(goodier等，front.immunol.,2016,7:384)。此外，还描述了adam17介导的cd16脱落限制了涉及adcc的利妥昔单抗或曲妥珠单抗抗体疗法的功效(romee等，blood,2013,121(18):3599–3608)。因此，活化的免疫效应细胞上cd16表达的下调可限制或调节其活性和adcc介导的细胞毒性。另一方面，cd16抑制剂和经转染以表达不可切割形式的cd16的nk细胞的使用揭示了在nk细胞活化时cd16脱落对于nk细胞从调理(opsonized)靶细胞脱离被认为是重要的，以此维持nk细胞存活并增加靶细胞的连续接合(srpan等，j.cell.biol.,2018,217(9):3267-3283)。

4、总之，本领域仍然需要提供用于免疫肿瘤治疗的高效抗-cd16a双特异性抗体构建体以通过结合cd16a诱导免疫效应细胞活化，从而允许高细胞因子产生和活化nk细胞的长期持续靶细胞杀伤。本发明解决了如本文所指出的这种需要。

技术实现思路

1、本发明至少部分基于以下惊人的发现：包含高亲和力抗-cd16a第一结合结构域和针对靶细胞表面上的抗原的第二结合结构域的双特异性抗体构建体可有效活化和重定向免疫效应细胞以进行adcc，从而避免cd16a脱落和接合的效应细胞立即失活。具体而言，本发明人出人意料地观察到，尽管存在靶细胞，当与低亲和力抗-cd16a结合结构域相比时，本发明的抗体构建体包含的高亲和力抗-cd16a结合结构域强烈稳定活化后的nk效应细胞上的cd16a表达。在这方面，由本发明双特异性抗体构建体活化的免疫效应细胞显示高细胞毒性活性并诱导靶细胞裂解而无活化诱导的cd16a脱落。这对于治疗血液癌症疾病是有益的，因为在循环nk细胞能够到达它们的预期肿瘤靶标(该种预期肿瘤靶标也位于骨髓中)之前，循环nk细胞上的cd16a脱落是很大的缺点。此外，在nk细胞存在有限的实体瘤中，cd16脱落对于效应细胞杀伤多种肿瘤细胞靶标的能力将是很大的缺点。如实施例1、2和12所示，当与其他cd16a结合结构域相比时，包含特异性cd16a结合结构域(本文也称为cd16a1抗-cd16a效应结构域或cd16a1结构域)的本发明的双特异性抗体对人cd16a显示更高亲和力(参见图1、2和16以及表3和15)。此外，如实施例5所示，当与由其它cd16a结合结构域诱导的脱落抑制相比时，包含特异性cd16a结合结构域的本发明的双特异性抗体显示对刺激的nk细胞的显著cd16脱落抑制作用(参见图5和6)。然而，如实施例4中所证明的，包含特异性cd16a结合结构域的本发明的双特异性抗体还显示出对靶细胞具有低皮摩尔浓度范围的ec50值的高裂解潜力(参见图4和17)，并显示出低的靶细胞非依赖性活化(参见图7和18)。总之，包含本发明的高亲和力抗-cd16a结合结构域的抗体构建体令人惊讶地具有高细胞毒性活性，尽管这些构建体在nk细胞活化时防止cd16a脱落。

2、因此，本发明的抗体构建体可用于肿瘤治疗，特别是血液肿瘤，因为本发明的抗体构建体不仅能够通过cd16a受体的高亲和性结合激活nk细胞，还实现了nk细胞的长期持续激活而不损失cd16a。因此，本发明的双特异性抗体构建体导致经由cd16a的效应nk细胞的高亲和性结合和经由细胞介导的细胞毒性的靶细胞的有效杀伤，从而允许持续的效应细胞活化。因此，本发明的抗体构建体可用于有效靶向各种癌症疾病，特别是血液肿瘤，并且必须被认为优于包含低亲和力cd16a结合结构域(例如本文公开的cd16a2或cd16a4抗-cd16a效应结构域)的抗体构建体。

3、因此，本发明的抗体构建体还可用于肿瘤治疗，特别是实体瘤，比如卵巢、乳腺、肾、肺、结肠直肠和脑肿瘤，因为这些构建体不仅能通过cd16a受体的高亲和性结合激活nk细胞，还能实现nk细胞的长期持续激活而不损失cd16a。因此，本发明的双特异性抗体构建体导致经由cd16a的效应nk细胞的高亲和性结合和经由细胞介导的细胞毒性的靶细胞的有效杀伤，从而允许持续的效应细胞活化。因此，本发明的抗体构建体可用于有效靶向各种癌症疾病，特别是实体瘤，比如卵巢、乳腺、肾、肺、结肠直肠和脑肿瘤，并且必须被认为优于包含低亲和力cd16a结合结构域(例如本文公开的cd16a2或cd16a4抗-cd16a效应结构域)的抗体构建体。

4、具体而言，本发明涉及一种双特异性抗体构建体，其包含(a)第一结合结构域(a)，其能够特异性结合第一靶标(a’)，所述第一靶标(a’)是免疫效应细胞表面上的cd16a，其中所述第一结合结构域包含：(i)包含如seq id no:4所示的cdr-l1、如seq id no:5所示的cdr-l2和如seq id no:6所示的cdr-l3的vl区，和(ii)如seq id no:7或seq id no:134所示的vh区；以及(b)第二结合结构域(b)，其能够特异性结合第二靶标(b’)，所述第二靶标(b’)是靶细胞表面上的抗原。

5、本发明还涉及一种核酸分子，其包含编码本发明的抗体构建体的序列。

6、本发明还涉及一种载体，其包含本发明的核酸分子。

7、本发明还涉及一种宿主细胞，其包含本发明的核酸分子或本发明的载体。

8、本发明还涉及一种产生本发明的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许本发明的抗体构建体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并任选地从培养物回收产生的抗体构建体。

9、本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的抗体构建体或通过本发明的方法产生的抗体构建体。

10、本发明还涉及一种本发明的抗体构建体，其用于治疗。

11、本发明还涉及一种治疗或改善增殖性疾病、肿瘤性疾病、病毒性疾病或免疫性障碍的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本发明的抗体构建体或通过本发明的方法产生的抗体构建体的步骤。

12、本发明还涉及一种试剂盒，其包含本发明的抗体构建体或通过本发明的方法产生的抗体构建体、本发明的核酸分子、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞。