一种修复皮肤屏障的VEGF改构蛋白及其在植物中表达的方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种修复皮肤屏障的vegf改构蛋白及其在植物中表达的方法。

背景技术：

1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)是血小板衍生生长因子(pdgf)家族中的成员。vegf能诱导已有血管的再生(血管再生)或新血管的生长(血管新生)，是胚胎发育和血管修复的关键因子。vegf的家族成员包括vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、vegf-e以及胎盘生长因子1、2(pigf-1、pigf-2)。其中vegf-a是内皮细胞迁移、增殖、血管舒张和血管形成最有效的因子12。vegf-amrna因剪接方式不同形成不同变构体，vegf165是其体内含量最多的变构体，且促血管生物活性最强，为vegf-a亚型中的主要效应分子，在实验和临床中应用最广。

2、vegf165是165个氨基酸组成的多肽，且富含半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基间形成了4对二硫键。二硫键主要维持了vegf的空间结构，vegf165的n端包含受体结合区，c端包含功能区。vegf受体结合区能分别与vegfr1、2结合，当vegf与相应受体结合后引发c端的功能区磷酸化，激活mapk信号通路，发挥着促血管生成，促角质形成细胞增殖、分化的作用。vegfr1和vegfr2在肿瘤细胞表面多表达，是vegf促肿瘤血管生成的关键受体。

3、vegf在促进血管生成和修复方面具有显著作用，能够加速伤口愈合和改善皮肤屏障功能。然而，由于vegf与vegfr1、2的结合，其潜在的致癌风险不容忽视。vegf的生物学特性使得它可能引发不必要的副作用和并发症，这在一定程度上阻碍了其在医学生物学领域的应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种新型vegf改构蛋白(vegft)，去除了vegf序列的vegfr1和vegfr2结合区(n端100个氨基酸残基)，但保留了c端65个氨基酸残基，从而保留了vegf维持空间构象的全部二硫键。改构后的vegf保留了促进角质形成细胞(keratinocyte，kc)增殖与分化从而修复皮肤屏障的功能，在降低了促肿瘤血管生成的风险的同时，还减小了分子量，并且提高了透皮效率，极大地扩宽了vegf的应用前景。

2、此外，本发明还采用了植物生物反应器表达本发明所提供的vegf改构蛋白(vegft)。植物生物反应器属于真核表达系统，因此具有完备的蛋白翻译后修饰功能，相较于动物细胞表达系统不含热源于内毒素，没有潜在的致病风险，而且植物不含使人致敏的物质，提高了使用安全性与舒适感。加之，植物生物反应器制备药用蛋白所需成本相对较低，且制备过程易于操作等优点，是制备外用型药用蛋白理想的系统。

3、本发明的技术方案是这样实现的：

4、第一方面，本发明提供了一种vegf改构蛋白，所述vegf改构蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述vegf改构蛋白被命名为vegft。

5、第二方面，本发明提供了一种修复皮肤屏障的组合物，所述组合物中包括所述vegf改构蛋白。

6、第三方面，本发明提供了所述vegf改构蛋白或所述组合物在制备皮肤屏障损伤修复的产品中的应用，所述产品包括化妆品、护肤品或药物。

7、第四方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子为如下中的一种：(1)所述的核酸分子编码权利要求1所述的vegf改构蛋白；(2)所述核酸分子的序列如seq id no.2所示。

8、第五方面，本发明提供了一种质粒载体，所述质粒载体包含所述核酸分子。

9、第六方面，本发明提供了所述质粒载体的制备方法，所述方法包括如下步骤：

10、s1、人工合成或基因克隆编码vegft的核酸，得到vegft基因片段；

11、s2、将步骤s1中得到的vegft基因片段与表达载体相连接，转化和/或转染进宿主细胞，筛选阳性克隆并提取质粒。

12、第七方面，本发明提供了一种在植物中表达vegft的方法，包括步骤：用质粒载体转化受体植物，所述质粒载体为上述制备方法中的任一项方法所制备而得，然后经筛选鉴定获得转基因成功的株系并提取vegft。

技术特征：

1.一种vegf改构蛋白，其特征在于，所述vegf改构蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述vegf改构蛋白被命名为vegft。

2.一种修复皮肤屏障的组合物，其特征在于，所述组合物中包括权利要求1所述的vegf改构蛋白。

3.权利要求1所述的vegf改构蛋白或权利要求2所述的组合物在制备皮肤屏障损伤修复的产品中的应用，其特征在于，所述产品包括化妆品、护肤品或药物。

4.一种核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下中的一种：(1)所述的核酸分子编码权利要求1所述的vegf改构蛋白；(2)所述核酸分子的序列如seq id no.2所示。

5.一种质粒载体，其特征在于，所述质粒载体包含权利要求4所述的核酸分子。

6.权利要求5所述的质粒载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的质粒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，基因克隆编码vegft的核酸的上下游引物分别如seq id no.3和seq id no.4所示。

8.根据权利要求6所述的质粒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，使用限制性内切酶nco i和bste ii，分别酶切pgm3301载体及步骤s1中得到的vegft基因片段，得到酶切后线性化的pgm3301载体以及酶切后的vegft基因片段，采用t4dna连接酶体系孵育过夜，然后转化和/或转染进宿主细胞，筛选阳性克隆并提取质粒。

9.一种在植物中表达vegft的方法，其特征在于，包括步骤：用质粒载体转化受体植物，所述质粒载体为根据权利要求6-8中任一项所述的制备方法所制备而得，然后经筛选鉴定获得转基因成功的株系并提取vegft。

10.根据权利要求9所述的在植物中表达vegft的方法，其特征在于，所述受体植物为拟南芥，所述质粒载体转化受体植物是由农杆菌介导的，所述筛选鉴定获得转基因成功的株系的步骤中具体还包括：根据抗性标记筛选出转基因成功的t0代植株获得t1代种子，继续播种和扩繁直至筛选出t3代纯合植株，然后进行pcr鉴定和蛋白表达水平检测，从而筛选得到vegft高表达的株系。

技术总结本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种修复皮肤屏障的VEGF改构蛋白(VEGFt)及其在植物中表达的方法。本发明公开了一种新型VEGF改构蛋白。通过精确改造，该蛋白去除了与VEGFR1和VEGFR2的结合区，从而显著降低了其促进肿瘤血管生成的风险；同时，仍保留了修复皮肤屏障的关键功能，并提高了透皮效率。此外，本发明还创新性地采用了植物生物反应器来表达所述VEGF改构蛋白，利用含有VEGFt基因片段的质粒载体转化受体植物，从成功转基因的植物株系中提取VEGFt。这种方法不仅提高了生物安全性和稳定性，还有助于降低生产成本，因此具有广阔的应用前景。技术研发人员：李校堃,林丽,高爽,龚方华,张宏宇,胡振林,宣暄,许诺受保护的技术使用者：温州医科大学技术研发日：技术公布日：2024/8/27