一种小鼠肠道病原体的高通量检测引物组、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及分子检测，具体涉及一种小鼠肠道病原体的高通量检测引物组、试剂盒及应用。

背景技术：

1、实验动物检疫是剔除不合格动物，最大限度避免病原微生物入侵，减少实验人员对人畜共患病的暴露，有效避免实验环境污染的重要措施，是保证实验环境安全和动物实验质量的重要环节，能够最大限度避免或控制有害生物因子的危害，以确保实验动物的健康和动物设施的安全运行。

2、实验动物的疾病防治，应以卫生的饲养管理、严格的检疫及预防为主为原则。在动物实验室中定期检疫是预防和控制动物疾病传播的重要手段。其中检测动物疾病的技术有很多，主要包括肉眼检查、流式细胞分析、实时荧光pcr检测、免疫测定、动物病毒分离等技术。但是目前常规的检测方法是对不同的病原体分别进行检测，实验周期长且成本较高，比较复杂和繁琐。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种小鼠肠道病原体的高通量检测引物组、试剂盒及应用，以克服现有技术检测周期长且成本高的问题。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种小鼠肠道病原体的高通量检测引物组，所述引物组包括引物对a-f1和a-r1、b-f1和b-r1、c-f1和c-r1、d-f1和d-r1、e-f1和e-r1、f-f1和f-r1、g-f1和g-r1、a-f2和a-r2、b-f2和b-r2、c-f2和c-r2、d-f2和d-r2、e-f2和e-r2、f-f2和f-r2、g-f2和g-r2；

4、所述a-f1和a-r1、b-f1和b-r1、c-f1和c-r1、d-f1和d-r1、e-f1和e-r1、f-f1和f-r1、g-f1和g-r1的核苷酸序列依次如seq id no：1-14所示；

5、所述a-f2和a-r2、b-f2和b-r2、c-f2和c-r2、d-f2和d-r2、e-f2和e-r2、f-f2和f-r2、g-f2和g-r2的核苷酸序列依次如seq id no：15-28所示。

6、作为本发明所述的高通量检测引物组的优选实施方式，所述a-f1和a-r1、b-f1和b-r1、c-f1和c-r1、d-f1和d-r1、e-f1和e-r1、f-f1和f-r1、g-f1和g-r1的摩尔比为(0.6-1.4)：(0.2-0.4)：(0.3-0.5)：(1.4-1.6)：(0.6-0.8)：(1.6-2.4)：(0.2-0.4)。

7、作为本发明所述的高通量检测引物组的优选实施方式，所述a-f2和a-r2、b-f2和b-r2、c-f2和c-r2、d-f2和d-r2、e-f2和e-r2、f-f2和f-r2、g-f2和g-r2的摩尔比为(0.1-0.3)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)。

8、作为本发明所述的高通量检测引物组的优选实施方式，所述a-f2、b-f2、c-f2、d-f2、e-f2、f-f2、g-f2连接有荧光标记。

9、第二方面，本发明提供了一种检测试剂，包含所述的高通量检测引物组，以及可接受的辅料和助剂。

10、第三方面，本发明提供了一种检测试剂盒，其特征在于，包含所述的高通量检测引物组或所述的检测试剂，以及可接受的辅料和助剂。

11、第四方面，本发明将所述的高通量检测引物组、所述的检测试剂、所述的检测试剂盒在检测实验动物的病原体中应用。

12、作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述病原体为肠内容物病原体。

13、作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述病原体包括沙门菌、鼠棒状杆菌、泰泽病原体、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。

14、第五方面，本发明提供了一种高通量的小鼠肠道病原体检测方法，包括以下步骤：

15、(1)取待测小鼠的肠内容物，提取所述肠内容物中的基因组dna；

16、(2)以所述基因组dna为模板，以所述a-f1和a-r1、b-f1和b-r1、c-f1和c-r1、d-f1和d-r1、e-f1和e-r1、f-f1和f-r1、g-f1和g-r1的混合物为引物，做第一次巢式pcr反应；

17、(3)以得到第一次巢式pcr反应的反应产物为模板，以所述a-f2和a-r2、b-f2和b-r2、c-f2和c-r2、d-f2和d-r2、e-f2和e-r2、f-f2和f-r2、g-f2和g-r2的混合物为引物，做第二次巢式pcr反应；

18、(4)根据得到第二次巢式pcr反应的反应产物分析判断病原体的种类，即成。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

20、本发明的小鼠肠道病原体的高通量检测引物组可同时对大量的小鼠肠道内容物进行检测，可同时对不同病原体进行检测。利用两次pcr的方式对病原体进行检测，增强了特异性，排除假阳性和假阴性结果，准确率大大提高，并且操作简单，时间短，成本低。将病原体的dna与正常小鼠(无病原体感染)肠道内容物dna混合(1：10、1：100、1：1000、1：10000和1：100000)，发现1：10000混合时，依然能从混合样品中检测到病原体dna。本发明的检测方法能快速且准确的判断小鼠是否有病原体感染，如果有感染，能准确辨认感染的病原体种类。

技术特征：

1.一种小鼠肠道病原体的高通量检测引物组，其特征在于，所述引物组包括引物对a-f1和a-r1、b-f1和b-r1、c-f1和c-r1、d-f1和d-r1、e-f1和e-r1、f-f1和f-r1、g-f1和g-r1、a-f2和a-r2、b-f2和b-r2、c-f2和c-r2、d-f2和d-r2、e-f2和e-r2、f-f2和f-r2、g-f2和g-r2；

2.根据权利要求1所述的高通量检测引物组，其特征在于，所述a-f1和a-r1、b-f1和b-r1、c-f1和c-r1、d-f1和d-r1、e-f1和e-r1、f-f1和f-r1、g-f1和g-r1的摩尔比为(0.6-1.4)：(0.2-0.4)：(0.3-0.5)：(1.4-1.6)：(0.6-0.8)：(1.6-2.4)：(0.2-0.4)。

3.根据权利要求1所述的高通量检测引物组，其特征在于，所述a-f2和a-r2、b-f2和b-r2、c-f2和c-r2、d-f2和d-r2、e-f2和e-r2、f-f2和f-r2、g-f2和g-r2的摩尔比为(0.1-0.3)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)。

4.根据权利要求1所述的高通量检测引物组，其特征在于，所述a-f2、b-f2、c-f2、d-f2、e-f2、f-f2、g-f2连接有荧光标记。

5.一种检测试剂，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的高通量检测引物组，以及可接受的辅料和助剂。

6.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的高通量检测引物组或权利要求4所述的检测试剂，以及可接受的辅料和助剂。

7.权利要求1-4任一项所述的高通量检测引物组、权利要求5所述的检测试剂、权利要求5所述的检测试剂盒在检测实验动物的病原体中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病原体为肠内容物病原体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述病原体包括沙门菌、鼠棒状杆菌、泰泽病原体、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。

10.一种高通量的小鼠肠道病原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结本发明属于分子检测技术领域，公开了一种小鼠肠道病原体的高通量检测引物组、试剂盒及应用。本发明提供了一种小鼠肠道病原体的高通量检测引物组，可同时对不同病原体进行检测。利用两次PCR的方式对病原体进行检测，增强了特异性，排除假阳性和假阴性结果，准确率大大提高，并且操作简单，时间短，成本低。本发明的检测方法能快速且准确的判断小鼠是否有病原体感染，如果有感染，能准确辨认感染的病原体种类。技术研发人员：涂续钢,唐玉巧,胡策受保护的技术使用者：广东泛普生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/27