一种组织特异性表达和非生物胁迫响应的启动子及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种组织特异性表达和非生物胁迫响应的启动子及其应用。

背景技术：

1、非生物胁迫对农作物的产量影响较大，在各种非生物胁迫中，盐胁迫和干旱胁迫经常同时发生，环境中水分的缺失导致植物生长受到影响，引起植物细胞脱水、离子平衡被打破，进而导致作物产量降低。植物为了保护自己免受缺水的危害，需要感知缺水带来的渗透胁迫，并触发信号转导通路，激活适应缺水的生理机制。因此，了解植物如何应对缺水对于提高植物抗应激性和提高田间作物生产力有着至关重要的作用。

2、通过基因工程育种培育耐逆作物是对抗逆境胁迫的有效途径。采用适当的启动子使转基因以所需的水平表达对获得高效的转基因植物非常重要。因此，通过基因工程培育抗旱耐盐农作物新品种已经成为当前迫切任务之一。在基因工程育种过程中，比较常用的启动子有组成型启动子和诱导型启动子。其中组成型启动子有camv35s启动子、ubiqitin启动子等。组成型启动子可以使目的基因在植物整个生长发育过程中高效表达，但是伴随大量营养消耗，影响植物的发育，表现为植物生长缓慢、矮小、产量降低等。而诱导型启动子在某些信号刺激或植物生长发育的特定组织或阶段启动外源基因转录，它不仅能使目的基因在特定时间或组织部位实现表达，还可以减少由于外源基因表达对植物发育的负面影响。可见，诱导型启动子在基因工程育种过程中的应用更为理想。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种组织特异性表达和非生物胁迫响应的启动子及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明首先提供了一种dna分子。

3、本发明提供的dna分子为如下1)或2)：

4、1)序列1所示的dna分子；

5、2)与1)限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的dna分子。

6、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的dna分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的dna分子的核苷酸序列70％或者更高同一性的核苷酸，只要具有启动子功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

7、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

8、为了实现上述目的，本发明又提供了与上述dna分子相关的生物材料。

9、本发明提供的与上述dna分子相关的生物材料为含有上述dna分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

10、上述生物材料中，所述表达盒(5’至3’)可包括启动子区(由所述dna分子组成)、转录起始区、目的基因区、转录终止区和任选的翻译终止区。所述启动子区和目的基因区对宿主细胞而言可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和目的基因区相互之间可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和/或目的基因区对宿主而言或者其相互之间为异源的。“异源的”指序列为源自外来物种的序列，或，如果来自相同物种，则通过刻意的人为干预在组分和/或基因组位点方面对天然形式进行了实质性修饰。任选含有的转录终止区可与转录起始区同源，与可操作地连接的目的基因区同源，与宿主同源；或；目的基因区、宿主为外源或异源。

11、所述表达盒还可包括5’引导序列。5’引导序列可增强翻译。

12、在制备表达盒时，可应用衔接头连接dna片段、或、可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位点、去除多余的dna、去除限制酶切位点等。为达到这一目的，可进行体外突变、引物修复、限制性酶切、退火、重新替换，例如转换和颠换。

13、所述表达盒还可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记例如荧光蛋白。以上列出的选择性标记不具有限制性。本发明可使用任何选择性标记基因。

14、上述生物材料中，所述载体是指以上述dna分子作为启动子将目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。

15、上述生物材料中，所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(escherichia sp.)、欧文氏菌属(erwinia sp.)、土壤杆菌属(agrobacterium sp.)、黄杆菌属(flavobacterium sp.)、产碱菌属(alcaligenes sp.)、假单胞菌属(pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(bacillus sp.)等但不限于此，例如所述细菌可为大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)。所述真菌可为酵母，所述酵母可来自酵母属(如酿酒酵母saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母属(如乳酸克鲁维酵母kluyveromyces lactis)、毕赤酵母属(如巴斯德毕赤酵母pichia pastoris)、裂殖酵母属(如非洲粟酒裂殖酵母schizosaccharomyces pombe)、汉逊酵母属(如多态汉逊酵母hansenula polymorpha)等但不限于此。所述真菌还可来自镰刀菌属(fusarium sp.)、丝核菌属(rhizoctonia sp.)、轮枝菌属(verticillium sp.)、青霉属(penicillium sp.)、曲霉属(aspergillus sp.)、头孢霉属(cephalosporium sp.)等但不限于此。所述放线菌可来自链霉菌属(streptomycessp.)、诺卡菌属(nocardia sp.)、小单孢菌属(micromonospora sp.)、链孢囊菌属(streptosporangium sp.)、游动放线菌属(actinoplanes sp.)、高温放线菌属(thermoactinomyces sp.)等但不限于此。所述藻类可来自墨角藻属(fucus sp.)、曲壳藻属(achnanthes sp.)、茧形藻属(amphiprora sp.)、双眉藻属(amphora sp.)、纤维藻属(ankistrodesmus sp.)、星胞藻属(asteromonas sp.)、黄金色藻属(boekelovia sp.)等但不限于此。所述病毒可为轮状病毒、疱疹病毒、流感病毒、腺病毒等但不限于此。

16、上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述dna分子转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖所述dna分子，也可用常规育种技术将所述dna分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

17、为了实现上述目的，本发明还提供了上述dna分子或生物材料的新用途。

18、本发明提供了上述dna分子在作为启动子中的应用。

19、在本发明的一个实施方案中，所述启动子为组织特异性启动子。

20、进一步的，所述组织包括根和/或茎和/或叶和/或花和/或果荚，其中，所述根不包括根尖；所述花不包括花瓣、花药和柱头。

21、更进一步的，所述叶片包括莲座叶和/或茎生叶。

22、在本发明的一个具体实施方案中，所述组织包括主根和/或侧根和/或根毛和/或茎和/或叶片表皮毛和/或莲座叶和/或茎生叶和/或花萼和/或花丝和/或子房和/或花柱和/或果荚。

23、在本发明的一个实施方案中，所述启动子为诱导型启动子。

24、进一步的，所述诱导型启动子为渗透胁迫诱导型启动子或盐胁迫诱导型启动子。

25、在本发明的一个具体实施方案中，所述渗透胁迫诱导型启动子为甘露醇胁迫诱导型启动子。

26、在本发明的另一个具体实施方案中，所述盐胁迫诱导型启动子为nacl胁迫诱导型启动子。

27、本发明还提供了上述dna分子或生物材料在启动目的基因表达或培育转基因植物或植物育种中的应用。

28、上述任一所述应用中，所述培育转基因植物或所述植物育种的目的为培育耐逆植物品种(如耐渗透胁迫植物品种或耐盐胁迫植物品种)或培育组织特异性表达的植物品种。

29、为了实现上述目的，本发明还提供了一种目的基因的表达方法。

30、本发明提供的目的基因的表达方法包括如下步骤：以上述dna分子作为启动子来启动目的基因表达。

31、上述任一所述启动目的基因表达可为在植物中启动目的基因表达。

32、上述任一所述启动目的基因表达可为在特定组织中启动目的基因表达。

33、进一步的，所述组织包括根和/或茎和/或叶和/或花和/或果荚，其中，所述根不包括根尖；所述花不包括花瓣、花药和柱头。

34、更进一步的，所述叶片包括莲座叶和/或茎生叶。

35、在本发明的一个具体实施方案中，所述组织包括主根和/或侧根和/或根毛和/或茎和/或叶片表皮毛和/或莲座叶和/或茎生叶和/或花萼和/或花丝和/或子房和/或花柱和/或果荚。

36、上述任一所述启动目的基因表达可为在渗透胁迫或盐胁迫条件下启动目的基因表达。

37、进一步的，所述渗透胁迫为甘露醇胁迫。

38、所述盐胁迫为nacl胁迫。

39、更进一步的，所述甘露醇胁迫为350mm甘露醇胁迫。

40、所述nacl胁迫为150mm nacl胁迫胁迫。

41、上述任一所述目的基因可为植物内源基因，也可为外源基因(如gus基因)。

42、上述任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

43、进一步的，所述双子叶植物可为十字花科植物。

44、更进一步的，所述十字花科植物可为拟南芥。

45、在本发明的具体实施例中，所述拟南芥为野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)。

46、扩增上述dna分子全长或部分片段的引物对也属于本发明的保护范围。

47、在本发明的一个具体实施方案中，所述引物对由序列2所示的dna分子和序列3所示的dna分子组成。

48、本发明提供了一种dna分子，通过实验证明：该dna分子不仅是一个组织特异性启动子，还是一个渗透胁迫或盐胁迫诱导型启动子，具有重要的应用价值。