高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌及其应用

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌及其应用。

背景技术：

1、微生物系统的不断发展，使得重组蛋白的生产技术发生了革命性的变化。高效、新型的微生物重组蛋白表达系统能够进一步降低重组蛋白的生产成本。大肠杆菌作为一种广泛使用的重组蛋白表达底盘，可以用于表达多种蛋白，其中bl21(de3)及其衍生物是最常用的蛋白表达菌株。大肠杆菌作为重组蛋白的表达底盘有明显的优点：大肠杆菌自身带有t7表达系统，能够表达pet等表达载体。大肠杆菌很容易获得高细胞密度培养，所需的营养成分简单易得，异源dna转化大肠杆菌效率高且简单快速。但是其仍存在一些缺点，比如缺乏生物活性、产物不稳定,而且大肠杆菌并不能表达任何我们想表达的蛋白，比如膜蛋白、有毒性蛋白等。

2、pet系统被广泛用来表达外源重组蛋白。一般将目标蛋白基因置于t7启动子下游，而t7启动子只能由t7rna聚合酶起始转录。t7rna聚合酶具备高催化活力，它的转录速度比大肠杆菌内源的rna聚合酶的转录速度快约8倍。当t7rna聚合酶被充分诱导时，能够利用细胞中的大部分材料来起始目的蛋白的转录，且在数小时后，目标蛋白能够超过细胞总蛋白的50％。

3、需钠弧菌是一种革兰氏阴性、对人类非致病的海洋细菌。其倍增时间在7～10分钟之间，传代速度比大肠杆菌快一倍，是已知代时最短的自由生活细菌，或可发展为一个特色表达系统。研究发现需钠弧菌单个细胞核糖体数量高达115000个，而大肠杆菌只有约70000～90000个，这意味着其具有更快的生物量合成速度和更强的蛋白表达能力。需钠弧菌的高生长和高底物摄取速率在作为宿主表达外源蛋白时，有望在前期快速生长，缩短发酵延滞期，在工业生产中节约能量和时间成本。野生型需钠弧菌没有t7rna聚合酶，所以无法使用t7表达系统。但是已有研究者将t7rna聚合酶表达框整合到需钠弧菌染色体中，并用gfp去测试t7表达系统，结果符合预期，这说明需钠弧菌有潜力成为快速重组表达的底盘。但是目前t7表达系统的强度是固定的，但不同的蛋白有其自身适合的表达强度，目前的固定强度并不适用于任何蛋白的高效表达。

4、到目前为止，尚未有研究报道需钠弧菌在t7表达系统中t7rnap的适当表达强度。

技术实现思路

1、本发明提供了一种高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌及其应用，该工程菌能够高效表达外源导入的重组质粒上的重组蛋白，从而显著提高工程菌蛋白质产量。

2、具体技术方案如下：

3、一种高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，包括需钠弧菌和在需钠弧菌内表达且自我复制的重组质粒，所述需钠弧菌的基因组中t7rna聚合酶的上游序列发生替换；

4、替换方式为下列之一：

5、1)，上游启动子替换成tet启动子；

6、2)，rbs序列替换成rbs1序列，rbs3序列，rbs4序列，rbs5序列，rbs6序列，rbs8序列，rbs10序列，rbs11序列或rbs12序列；

7、3)，1)和2)同时发生替换；

8、所述重组质粒中包含有外源重组蛋白，且外源重组蛋白的上游含有t7启动子；所述上游启动子的碱基序列如seq id no.16所示，rbs序列的碱基序列如seq id no.17所示；

9、所述tet启动子的碱基序列如seq id no.1所示；所述rbs1的碱基序列如seq idno.2所示；所述rbs3的碱基序列如seq id no.4所示；所述rbs4的碱基序列如seq id no.5所示；所述rbs5的碱基序列如seq id no.6所示；所述rbs6的碱基序列如seq id no.7所示；所述rbs8的碱基序列如seq id no.9所示；所述rbs10的碱基序列如seq id no.11所示；所述rbs11的碱基序列如seq id no.12所示；所述rbs12的碱基序列如seq id no.13所示。

10、进一步地，所述需钠弧菌的株型为需钠弧菌(vibrio natriegens)atcc14048，其为市售产品，可购于atcc。

11、进一步地，所述外源重组蛋白为葡萄糖脱氢酶。

12、进一步地，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.14所示。

13、进一步地，所述t7rna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.15所示。

14、本发明提供了所述的需钠弧菌工程菌在高产外源重组蛋白中的应用。

15、进一步地，所述的外源重组蛋白为葡萄糖脱氢酶。

16、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

17、本发明通过对需钠弧菌基因组中t7rna聚合酶的上游序列进行天然转化，获得了能够高表达外源导入重组质粒上的重组蛋白(尤其是葡萄糖脱氢酶)，可显著提高工程菌外源蛋白的产量，具有推广应用前景。

技术特征：

1.一种高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，包括需钠弧菌和在需钠弧菌内表达且自我复制的重组质粒，所述需钠弧菌的基因组中整合了含启动子tet和rbs为rbs1的t7 rna聚合酶表达盒；

2.如权利要求1所述的高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，所述需钠弧菌的株型为需钠弧菌(vibrio natriegens)atcc14048。

3.如权利要求1所述的高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，所述外源重组蛋白为葡萄糖脱氢酶。

4.如权利要求1所述的高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.14所示。

5.如权利要求1所述的高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，所述t7rna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.15所示。

6.如权利要求1所述的高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌，其特征在于，所述重组质粒的原始表达载体为pet载体。

7.如权利要求1～6任一项所述的需钠弧菌工程菌在高产外源重组蛋白中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的外源重组蛋白为葡萄糖脱氢酶。

技术总结本发明公开了一种高产重组蛋白的需钠弧菌工程菌及其应用，该工程菌包括需钠弧菌和在需钠弧菌内表达且自我复制的重组质粒，所述需钠弧菌的基因组中整合了含启动子tet和RBS为RBS1的T7RNA聚合酶表达盒；所述重组质粒中包含有外源重组蛋白的基因，且所述基因的上游含有T7启动子；所述tet启动子的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述RBS1的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过对需钠弧菌基因组中T7RNA聚合酶的上游序列进行天然转化，获得了能够高表达外源导入重组质粒上的重组蛋白(尤其是葡萄糖脱氢酶)，可显著提高工程菌外源蛋白的产量，具有推广应用前景。技术研发人员：徐佳琪,孙艺洁,杨立荣,吴坚平受保护的技术使用者：浙江大学杭州国际科创中心技术研发日：技术公布日：2024/8/27