重组猪源C反应蛋白及单克隆抗体制备及应用

本发明涉及生物，具体涉及一种猪c反应蛋白、猪c反应蛋白单克隆抗体、检测试剂盒及应用。

背景技术：

1、c反应蛋白(c-reactive protein,crp)是一种主要由肝脏的肝细胞合成和分泌的一种急性期蛋白。crp的产生主要是肝细胞对体内il-6等炎症因子的响应。当机体受到感染、肿瘤生长或组织创伤等损害免疫稳态时，炎症刺激会促使肝脏增加crp的合成，导致血液中crp水平升高，crp水平不特异于任何特定类型的炎症。目前，人crp水平检测应用广泛：包括发炎和感染的诊断及检测、心血管疾病风险评估、自身免疫疾病的监测、癌症管理及术后感染的监测等。crp是辅助诊断和管理各种疾病时常用的工具之一，通过将crp水平与其他临床信息和检测结果一起考虑，可以帮助做出准确的诊断和治疗决策。

2、目前，我国猪场疾病可以分为病毒性疾病(非洲猪瘟、口蹄疫、猪瘟、猪流行性腹泻、伪狂犬病等)和细菌性疾病(猪链球菌病、猪胸膜肺炎、猪多杀不动杆菌病等)。当在猪只由于感染细菌引发炎症反应时，血清crp含量显著上升，并且不同感染疾病对血清中crp上升水平不同，通常健康的猪只确定crp浓度约为1-2μg/ml，猪链球菌感染crp浓度约为15-20μg/ml，多杀巴氏杆菌感染导致crp浓度可以达到200μg/ml左右，crp浓度是全身炎症反应的强力指标，在评估猪群炎症水平的同时，可以辅助诊断猪群感染大致病原，为早期诊断、隔离、治疗提供有力指导作用。此外，这种检测试剂盒的应用也有助于科研人员在炎症、免疫学和传染病领域的研究。

3、大量中小猪场出现猪只感染情况，其中细菌性感染尤为严重，但目前使用检测方法多为菌体分类及pcr鉴定，该方法流程繁琐、耗时过长，严重影响猪场早期诊断和治疗。目前，猪只血清crp检测方法主要是通过乳胶凝集检测、血常规crp检测；乳胶凝集检测不能检测精确crp浓度；血常规crp检测由于机器成本、样本要求，难以在中小型猪场普及。

4、综上所述，根据目前市面上检测方法存在的技术缺陷，急需寻找一种灵敏度高、特异性强，且能够实现猪场快速检测猪血清crp的有效手段。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种优化的猪c反应蛋白基因序列并进行可溶性表达，通过筛选获得的猪c反应蛋白单克隆抗体，并建立了一种猪血清crp夹心elisa检测方法，实现对猪c反应蛋白定量检测。

2、为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

3、本发明的第一个目的是提供一种编码猪c反应蛋白的基因，所述核苷酸序列如seqid no.1所示。

4、本发明的第二个目的是提供一种重组载体，所述重组载体含有前述编码猪c反应蛋白的基因序列。

5、在某个特殊的实施例中，所述重组载体的基础载体为pet-28a。

6、本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌含有前述的重组载体和与该重组载体共表达的伴侣蛋白表达载体。

7、在某个特殊的实施中，所述伴侣蛋白表达载体为分子伴侣质粒ptf16。ptf16能够促进工程菌c反应蛋白的可溶性表达；理论功能是蛋白错误折叠是蛋白质活性丧失，不可溶的原因；我们通过宿主在共表达分子伴侣蛋白和c反应蛋白，分子伴侣蛋白促进c反应蛋白的正确折叠，实现对可溶性c反应蛋白的表达。

8、进一步的，所述基因工程菌能够表达可溶性猪c反应蛋白。

9、本发明的第四个目的是提供猪c反应蛋白重组蛋白，所述猪c反应蛋白重组蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示，所述氨基酸序列由seq id no.1编码。

10、在某个特殊的实施例中，所述猪c反应蛋白重组蛋白由前述基因工程菌表达得到。

11、本发明的第五个目的是提供前述猪c反应蛋白重组蛋白在制备猪c反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体中的应用。

12、本发明的第六个目的是提供一种猪c反应蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体以前所述猪c反应蛋白重组蛋白作为抗原制备获得，所述单克隆抗体含有vh重链可变区及vl轻链可变区；

13、所述单克隆抗体vh的氨基酸序列如seq id no.4所示；

14、所述单克隆抗体vl的氨基酸序列如seq id no.6所示；

15、所述vh和vl包括互补决定区，互补决定区由cdr1、cdr2、cdr3组成；

16、所述单克隆抗体的vh的cdr-h1的氨基酸序列如seq id no.4中第1-30位所示；

17、所述单克隆抗体的vh的cdr-h2的氨基酸序列如seq id no.4中第36-49位所示；

18、所述单克隆抗体的vh的cdr-h3的氨基酸序列如seq id no.4中第99-111位所示；

19、所述单克隆抗体的vl的cdr-l1的氨基酸序列如seq id no.6中第24-38位所示；

20、所述单克隆抗体的vl的cdr-l2的氨基酸序列如seq id no.6中第54-60位所示；

21、所述单克隆抗体的vl的cdr-l1的氨基酸序列如seq id no.6中第93-96位所示。

22、进一步的，所述编码单克隆抗体的vh重链可变区核苷酸序列如seq id no.3所示；编码单克隆抗体的vl重链可变区核苷酸序列如seq id no.5所示。

23、本发明的第七个目的是提供前述编码猪c反应蛋白的基因，或前述重组载体，或前述基因工程菌，或前述猪c反应蛋白重组蛋白，或前述猪c反应蛋白单克隆抗体在制备猪c反应蛋白elisa检测试剂盒中的应用。

24、本发明的第八个目的是提供一种猪c反应蛋白elisa检测试剂盒，所述试剂盒包括前述猪c反应蛋白单克隆抗体。

25、本发明的第九个目的是提供一种检测猪c反应蛋白的elisa方法，所述elisa方法使用前述猪c反应蛋白单克隆抗体进行捕获抗体包被，使用如上所述的猪c反应蛋白作为抗原建立标准曲线检测猪c反应蛋白。

26、所述elisa方法的条件包括：所述标准曲线线性范围为31.25～1000ng/ml，捕获抗体浓度为4μg/ml，包被条件为4℃12h，封闭液为5％脱脂乳，封闭条件为37℃2h，结合抗体稀释度为1：2000，结合抗体作用条件为37℃1h，酶标抗体稀释度为1：4000，结合抗体作用条件为37℃45min，显色时间为37℃30min。

27、在某特特殊的实施例中，所述elisa方法检测猪血清中的c反应蛋白。

28、本发明的有益效果：

29、本发明提供了密码子优化后的猪c反应蛋白基因序列，提供了一种可溶性的猪c反应蛋白及一种猪c反应蛋白单克隆抗体，利用该蛋白及抗体制备的猪c反应蛋白夹心elisa检测试剂盒，对捕获抗体浓度、抗原浓度及结合时间、结合抗体浓度及结合时间、hrp抗体浓度及结合时间进行优化，最终建立了一种有效检测猪血清c反应蛋白浓度的夹心elisa检测方法，该方法灵敏度高、特异性强，可实现猪场猪群血清c反应蛋白的快速检测，具有较高的实用价值。