一种血液检测保存试剂、制备方法和检测试剂盒与流程

本发明涉及医药检测保存试剂，尤其涉及一种血液检测保存试剂、制备方法和检测试剂盒。

背景技术：

1、在现代医学和生物学研究中，血液样本分析正变得越来越重要。血液样本是最常见的样本类型之一，是临床上最容易获得的人体标本，常用来做各种检测和研究。血液在生物体内有着广泛的流动性和最重要的物质传输作用，分子成分主要包含代谢产物、生物激素、抗体、酶 、无机盐等，用以反映生物体最直接、最有效代谢情况是非常合适的。然而，血液样本的复杂性和多样性使得其中核酸的保护和提取面临诸多挑战。

2、譬如，rna在人类的许多的生理和病理过程中都发挥着至关重要的作用。高质量rna可以满足文库构建、rt-pcr、q-pcr、转录组测序、dot blot、芯片分析等。然而，rna本身为单链，极不稳定，且血液中大部分的核酸存在于白细胞中，而白细胞在血细胞中含量最少，并且血液中含有丰富的rna酶，同时许多外源性的因素如外源性的rna酶，保存和提取过程都可能影响rna的实验结果。这就使血液rna保存和提取非常棘手，常常因时间过久而发生降解。因此选择合适的血液检测保存试剂就显得非常重要。

3、影响核酸降解的因素很多，主要分为物理因素，化学因素和生物因素：

4、1.物理因素：温度，机械剪切力、核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等；

5、2.化学因素：ph值，水解反应，氧化反应等；

6、3.生物因素：酶解及微生物侵染等作用。

7、因此，血液检测保存试剂的配制需要重点考虑生物因素和化学因素，科学选择原料及其配备比例，避免核酸降解。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种血液检测保存试剂、制备方法和检测试剂盒，该保存试剂确保了血液样本在保存过程中的完整性和检测结果的准确性。

2、为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

3、一种血液检测保存试剂，该保存试剂包括以下组分：

4、抗凝剂：1-3mg/ml

5、海藻糖：5-35mm/l

6、rnase抑制剂：1-5u/μl

7、山梨糖醇：4.0-12.0%

8、pvp：0.1-2.0%

9、支链聚乙烯亚胺：1-10mg/ml

10、壳聚糖纳米颗粒：1-10mg/ml；

11、还包括抗氧化剂和缓冲体系，上述的百分比为质量百分比，ph值调节至7.3-7.5。

12、作为优选，该保存试剂包括以下组分：

13、抗凝剂：1.5-2mg/ml

14、海藻糖：10-30mm/l

15、rnase抑制剂：1-3u/μl

16、山梨糖醇：5.0-10.0%

17、pvp：0.5-1.5%

18、支链聚乙烯亚胺：2-5mg/ml

19、壳聚糖纳米颗粒：2-5mg/ml。

20、作为优选，所述抗凝剂选用edta；抗氧化剂选用谷胱甘肽和抗坏血酸中的一种或2种混合；缓冲体系选用tris-hcl和edta，缓冲体系ph值7.3-7.5。

21、作为优选，所述抗氧化剂选用谷胱甘肽和抗坏血酸，抗坏血酸：5-15mm/l，谷胱甘肽：2-10mm/l。

22、作为优选，所述缓冲体系的tris-hcl：5-15mm/l，edta：0.5-2.0mm/l。

23、作为优选，该保存试剂还包括甘油9-11%。

24、作为优选，所述支链聚乙烯亚胺分子量小于25000da，结构式如下所示：

25、；n为10-100。

26、进一步，本发明还公开了所述的保存试剂的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

27、1）制备抗凝剂溶液：向无菌蒸馏水中加入抗凝剂，使用磁力搅拌器搅拌，直到抗凝剂完全溶解；

28、2）添加核酸稳定剂：向抗凝剂溶液中依次添加海藻糖、rnase抑制剂、山梨糖醇、pvp、支链聚乙烯亚胺、壳聚糖纳米颗粒，并确保每种成分完全溶解后再添加下一种成分；

29、3）添加剩余试剂：添加抗氧化剂、缓冲体系和其他试剂，使用ph计监测溶液的ph值，并用tris-hcl调节溶液至ph值7.3-7.5；

30、4)过滤和灭菌：使用0.22µm过滤器对溶液进行过滤灭菌得到保存试剂,将保存试剂分装至无菌试剂瓶中，密封避光保存于4℃。

31、作为优选，所述试剂溶解温度为室温；步骤（1）中磁力搅拌器搅拌速度为600-800rpm。

32、进一步，本发明还公开了一种血液检测试剂盒，该试剂盒包括保存试剂管以及分装在保存试剂管内如上所述的保存试剂。

33、本发明各个成分的作用原理：

34、1. 抗凝剂

35、edta（乙二胺四乙酸）

36、原理：edta通过螯合血液中的钙离子，阻止凝血酶原转变为凝血酶，从而防止血液凝固。

37、作用：确保样本在采集后保持液态，便于后续处理和检测。

38、2. 核酸稳定剂

39、1）trehalose（海藻糖）

40、原理：trehalose是一种天然的二糖，能够通过形成保护膜来稳定细胞膜和核酸结构，防止降解，它还能保护细胞在干燥、热和冷等应激条件下被降解。

41、作用：保护核酸和细胞结构，防止因环境应激导致的降解。

42、3）rnase抑制剂（如ribolock rnase inhibitor）

43、原理：rnase抑制剂能够特异性地抑制rnase酶的活性，防止rna降解。

44、作用：保护rna不被降解，保持其完整性，确保rna检测的准确性。

45、4）sorbitol（山梨糖醇）

46、原理：sorbitol是一种低温保护剂和渗透压调节剂，能够保护细胞和核酸结构，防止低温条件下的冰晶形成。

47、作用：调节渗透压，保护细胞和核酸，特别是在低温保存条件下。

48、5）pvp（聚乙烯吡咯烷酮）

49、原理：pvp是一种高分子化合物，能够通过形成保护膜来防止核酸降解，并提供一定的抗氧化作用。

50、作用：稳定核酸结构，提供额外的保护，防止降解。

51、7）支链聚乙烯亚胺（bpei）

52、原理：支链pei具有强大的核酸结合能力，能够与核酸形成稳定的复合物，保护核酸免受降解酶的作用。

53、作用：保护核酸免受降解，确保其稳定性和完整性。

54、8）壳聚糖纳米颗粒

55、原理：壳聚糖具有生物相容性和抗菌性，纳米颗粒形式的壳聚糖能够有效稳定核酸结构，防止降解，同时提供抗菌保护。

56、作用：防止核酸降解并提供抗菌保护，确保样本的稳定性。

57、3. 抗氧化剂

58、1）抗坏血酸（维生素c）

59、原理：抗坏血酸是一种有效的抗氧化剂，能够中和自由基，防止氧化应激对细胞和核酸的损伤。

60、作用：保护细胞和核酸免受氧化损伤，保持样本的完整性。

61、2）谷胱甘肽（gsh）

62、原理：谷胱甘肽是一种天然的抗氧化剂，能够与氧化剂反应，防止细胞和核酸的氧化损伤。

63、作用：提供额外的抗氧化保护，确保样本稳定性。

64、4. 缓冲体系

65、1）tris-hcl

66、原理：tris-hcl缓冲体系能够维持溶液的ph稳定，防止核酸在酸性或碱性条件下降解。

67、作用：确保溶液的ph在适宜范围内，防止核酸降解。

68、2）edta

69、原理：作为缓冲体系的一部分，进一步保护核酸免受降解。

70、作用：增强缓冲体系的效果，提供额外的核酸保护。

71、5. 冷冻保护剂

72、甘油

73、原理：甘油是一种低温保护剂，能够防止冰晶形成，保护细胞和核酸结构，适用于长期冷冻保存。

74、作用：防止低温保存过程中冰晶对细胞和核酸的损伤，确保样本稳定性。

75、综上所述，本发明保存试剂配方设计综合考虑了血液样本在保存过程中的多种潜在降解途径，通过抗凝剂、核酸稳定剂、抗氧化剂和缓冲体系的协同作用，确保样本在保存过程中的稳定性和完整性。每种成分的具体作用和浓度都是根据其在防止降解、稳定核酸和保护细胞方面的效果精心设计的，确保最终配方能够满足血液检测保存的高标准要求。

76、本发明由于采用了上述的技术方案，具有以下的技术效果：

77、1、本发明采用了支链聚乙烯亚胺（bpei）作为主要成分，通过其独特的分子结构和化学性质，有效地提高了核酸的稳定性。支链pei具有高效的核酸结合能力，可以与血液中的dna和rna紧密结合，形成稳定的复合物，防止核酸在样本处理和保存过程中降解。实验结果显示，使用本发明处理的血液样本，其核酸完整性和质量显著优于传统方法。

78、2、本发明中包含的多种保护成分，如甘油、抗氧化剂（谷胱甘肽和抗坏血酸）、核酸稳定剂等，能够在多个层面上保护核酸，支链聚乙烯亚胺、海藻糖和山梨糖醇还具有一定的协同作用，减少核酸降解和损伤。这些成分的组合不仅提高了核酸的稳定性，还优化了提取过程，减少了杂质和抑制物的影响。结果显示，使用本发明处理的样本，其核酸提取效率显著提高，提取的核酸量更多，纯度更高。

79、3、本发明设计的保护试剂能够在常温和低温条件下长期保存血液样本，确保样本中的核酸在保存期间不受降解。配方中的抗氧化剂防止氧化应激对核酸的损伤。实验结果表明，使用本发明处理的样本在4℃和常温条件下分别保存数天和数月后，核酸仍然保持良好的稳定性和完整性。

80、4、本发明的设计考虑到了实际操作的简便性和可行性。在样本采集现场，血液样本可以直接放入含有本保护试剂的容器中，轻轻振荡混匀即可。这种简便快速的处理方法减少了样本暴露在外界环境中的时间，避免了核酸的降解，提高了核酸的保护效果。

81、5、本发明具有良好的兼容性，适用于不同类型的血液样本和各种下游核酸分析方法，如pcr、rt-pcr、测序等。

82、综上所述，本发明通过支链pei的创新应用和多种保护成分的协同作用，有效解决了血液样本中核酸保护和提取的难题，显著提高了核酸的稳定性、提取效率和保存性能，具备广泛的应用前景和重要的研究价值。