一种包含特定拷贝数基因修饰的T淋巴细胞标准样品及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种包含特定拷贝数基因修饰的t淋巴细胞标准样品及其制备方法和应用。

背景技术：

1、car-t疗法是备受瞩目的新型癌症免疫治疗策略，国内外已有十余项产品获批上市，慢病毒载体是car-t关键的基因递送工具，它携带car基因整合进t淋巴细胞基因组，使t淋巴细胞获得识别肿瘤细胞的能力。基因组整合的慢病毒载体基因拷贝数定量检测，一方面可以证明有效的基因修饰，另一方面也是控制二次肿瘤风险的量化指标。

2、但是由于细胞中基因修饰参考测量方法和拷贝数标准细胞对照样品的空缺，给car-t技术的转基因遗传剂量、安全性、有效性评价结果准确性造成一定风险。

3、因此，亟需提供一种与临床、研发机构检测靶标一致的具备明确慢病毒载体基因拷贝数量值的t淋巴细胞标准样品，以实现慢病毒载体基因拷贝数的准确和可靠定量。该标准样品可为car-t淋巴细胞治疗领域中紧迫的质量控制、放行检测、拷贝数检测方法的质量控制、基因拷贝数检测试剂盒研发质控等需求提供稳定、准确和可靠的检测靶标。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种包含特定拷贝数基因修饰的t淋巴细胞标准样品及其制备方法和应用。本发明提供两种基因修饰t细胞标准样品及其制备方法和应用，这两株t细胞标准样品其基因组中分别整合1个拷贝的慢病毒载体基因和2个拷贝的慢病毒载体基因。所述t淋巴细胞标准样品在car-t细胞治疗领域中具有重要的应用价值。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种包含特定拷贝数基因修饰的t淋巴细胞标准样品，所述t淋巴细胞标准样品包括：基因组中整合1个拷贝的慢病毒载体基因的t淋巴细胞；和基因组中整合2个拷贝的慢病毒载体基因的t淋巴细胞；

4、所述慢病毒载体基因包含慢病毒载体功能序列、融合基因、内部核糖体进入位点(ires)和报告基因；

5、所述融合基因包括flagtag标签、cd8alpha(138-206aa)、cd137(214-255aa)、cd3ζ(52-164aa)；所述融合基因的核苷酸序列包括seq id no:3所示。

6、本发明中，所述t淋巴细胞标准样品在临床检测中具有重要应用价值，(1)临床检测和基因修饰细胞药物中的慢病毒载体基因拷贝数检测结果多在2拷贝/细胞以下，本发明所述的两个t淋巴细胞标准样品分别包含1个慢病毒载体基因拷贝/细胞和2个慢病毒载体基因拷贝/细胞，满足实际质控使用需要；(2)本发明所述的两个t淋巴细胞标准样品的慢病毒载体基因拷贝数量值经过数字pcr、二代测序、流式细胞术多维验证，量值准确可靠且具有溯源性；(3)本发明所述的两个t淋巴细胞标准样品为细胞形态，可以为慢病毒载体基因拷贝数检测全过程质控(包括细胞收集、细胞裂解、基因组dna提取、基因组dna定量、慢病毒载体基因拷贝数定量等)。

7、本发明中所述慢病毒载体基因中慢病毒载体功能序列用于启动慢病毒载体基因的转录激活，调控慢病度载体基因整合到宿主细胞基因组。报告基因的功能为：报告基因可以在细胞内表达绿色荧光蛋白，可以通过检测其荧光来判断细胞是否被病毒感染；同时荧光蛋白荧光强度与报告基因拷贝数成正比，可用于评估慢病毒载体基因的拷贝数目。内部核糖体进入位点(ires)能够使蛋白质翻译起始不依赖于5’帽结构，使核糖体直接mrna中间起始翻译。融合基因包含了cd8alpha(138-206aa)、cd137(214-255aa)、cd3ζ(52-164aa)序列、flag tag标签序列，可作为外源基因修饰序列对慢病毒载体基因拷贝数进行检测和定量。

8、本发明中，选择rpl32基因作为内参基因，rpl32基因编码60s核糖体蛋白l32，为内源性持家基因，同时rpl32在一个染色体组中只包含一个拷贝，是理想的外源慢病毒载体基因定量参考。

9、本发明中，选择rev响应元件rre基因作为双重数字pcr定量细胞中整合的外源慢病毒载体基因拷贝数的目标基因。rre可与rev蛋白结合进而控制慢病毒基因所转录rna的出核转运和表达，对于慢病毒生产至关重要，rre基因存在于当前市面上绝大部分慢病毒载体中。

10、优选地，所述内部核糖体进入位点(ires)的核苷酸序列包括seq id no:2所示。

11、优选地，所述报告基因包括绿色荧光蛋白基因(zsgreen)。

12、优选地，所述报告基因的核苷酸序列包括seq id no:1所示。

13、优选地，所述慢病毒载体功能序列包括5’和3’端的长末端重复序列ltr、rev响应元件rre、ef1alpha启动子。

14、优选地，所述慢病毒载体基因包含慢病毒载体功能序列(5’和3’端的长末端重复序列ltr、rev响应元件rre、ef1alpha启动子)、融合基因、内部核糖体进入位点(ires)和绿色荧光蛋白基因(zsgreen)。

15、优选地，所述慢病毒载体基因的核苷酸序列包括seq id no:4所示。

16、第二方面，本发明提供一种第一方面所述的包含基因修饰的t淋巴细胞标准样品的制备方法，所述制备方法包括：

17、(1)构建包含慢病毒载体功能序列、融合基因、内部核糖体进入位点(ires)和报告基因的慢病毒载体；

18、(2)将慢病毒载体转染至t淋巴细胞；

19、(3)通过有限稀释法将感染慢病毒的t淋巴细胞分选成为单个克隆；

20、(4)培养单个克隆，获得遗传背景一致的基因修饰t淋巴细胞；取培养后的克隆进行数字pcr检测，并将剩余的克隆继续培养；基于数字pcr检测结果分别选取基因组中整合1个拷贝的慢病毒载体基因，和2个拷贝的慢病毒载体基因的t淋巴细胞，并保存作为t淋巴细胞标准样品。

21、本发明利用慢病毒感染技术将包含有报告基因的慢病毒载体整合进t淋巴细胞基因组中。本发明通过有限稀释法将感染慢病毒的t淋巴细胞分选成为单个克隆，然后继续培养单克隆获得遗传背景一致的基因修饰t淋巴细胞株。经过筛选得到基因组中整合1个拷贝的慢病毒载体基因，和2个拷贝的慢病毒载体基因的t淋巴细胞，记为vcn-1和vcn-2。本发明还通过光学显微成像，证明vcn-1和vcn-2基因修饰t淋巴细胞形态完整，且报告基因表达正常。本发明通过流式细胞术高通量检测vcn-1和vcn-2中报告基因的表达水平，证明vcn-2中的报告基因表达水平为vcn-1的两倍。本发明还通过二代测序证明vcn-1与vcn-2基因组中分别整合由1个拷贝和两个拷贝慢病毒载体基因。

22、优选地，步骤(1)中，所述慢病毒载体中包含seq id no:4所示的核苷酸序列。

23、优选地，步骤(2)中，所述慢病毒载体与t淋巴细胞的转染比例为(0.5-20):1，例如可以是0.5:1、1:1、2:1、4:1、5:1、6:1、8:1、10:1、12:1、14:1、15:1、16:1、18:1或20:1等。

24、优选地，所述慢病毒载体与t淋巴细胞的转染比例为(0.5-2):1，例如可以是0.5:1、1:1或2:1等；转染后获得的t淋巴细胞中包含整合1个拷贝的慢病毒载体基因的t淋巴细胞。

25、优选地，所述慢病毒载体与t淋巴细胞的转染比例为(5-20):1，例如可以是5:1、6:1、8:1、10:1、12:1、14:1、15:1、16:1、18:1或20:1等；转染后获得的t淋巴细胞中包含整合2个拷贝的慢病毒载体基因的t淋巴细胞。

26、本发明中，在低剂量转染比例下，所述慢病毒载体与t淋巴细胞的转染比例为(0.5-2):1，其中整合1个拷贝的慢病毒载体基因的t淋巴细胞的量较多，更容易筛选得到；在高剂量转染比例下，所述慢病毒载体与t淋巴细胞的转染比例为(5-20):1时，其中整合2个拷贝的慢病毒载体基因的t淋巴细胞的量较多，更容易筛选得到。

27、优选地，步骤(4)中，所述保存的条件为：首先使用4％的多聚甲醛按照1万细胞/1微升的比例固定t淋巴细胞，而后将固定后的t淋巴细胞使用包含10％-20％ fbs和9-11％dmso的dmem培养基稀释重悬，稀释重悬的比例为1-5万细胞/1μl，重悬细胞后于-80±5℃冷冻至少48h。

28、第三方面，本发明提供一种用于检测第一方面所述的包含基因修饰的t淋巴细胞标准样品的引物探针组合，所述引物探针组合用于检测t淋巴细胞标准样品中慢病毒载体基因的拷贝数；

29、所述引物包括seq id no:5-6所示；

30、所述探针包括seq id no:7所示。

31、优选地，所述引物探针组合还包用于检测内参基因rpl32的引物和探针。

32、优选地，所述检测内参基因rpl32的引物包括seq id no:8-9所示。

33、优选地，所述检测内参基因rpl32的探针包括seq id no:10所示。

34、本发明中所选用的引物探针用于本发明所述vcn-1、vcn-2研制过程中对细胞基因组整合的慢病毒载体拷贝数进行双重数字pcr绝对定量。双重数字pcr结果与二代测序结果和流式细胞术检测结果互相印证，确认vcn-1为1拷贝/细胞，vcn-2为2拷贝/细胞。

35、经双重数字pcr验证本发明中所选引物探针的重复性较好，检测结果准确可靠，因此该引物探针也可以用于qpcr定量检测过程的质量控制、慢病毒载体基因拷贝数检测方法建立、检测试剂盒有效性评价。

36、第四方面，本发明提供一种第一方面所述的包含基因修饰的t淋巴细胞标准样品的拷贝数检测方法，所述检测方法包括：

37、提取t淋巴细胞标准样品的基因组dna，采用第三方面所述的引物探针组合进行双重数字pcr扩增。

38、优选地，所述双重数字pcr退火温度为：52-62℃，例如可以是52℃、54℃、56℃、58℃、60℃或62℃等。

39、优选地，所述双重数字pcr扩增的体系中引物和探针的摩尔比为6:(1-4)，例如可以是6:1、6:2、6:3或6:4等。

40、本发明优化了慢病毒载体上的rre基因和细胞中的单拷贝基因rpl32对应的数字pcr引物和探针序列，引物和探针浓度，以及退火温度，本发明建立了针对vcn-1和vcn-2的高精度双重数字pcr反应体系。

41、本发明通过双重数字pcr技术同时检测同一样品中的rre基因和rpl32基因的拷贝数，通过公式(1)获得vcn-1和vcn-2中每个细胞里的慢病毒载体基因的拷贝数。双重数字pcr实验结果证明vcn-1中每个细胞基因组整合了1个慢病毒载体基因，vcn-2中的每个细胞基因组整合了2个慢病毒载体基因。

42、

43、第五方面，本发明提供第一方面所述的包含基因修饰的t淋巴细胞标准样品、第二方面所述的包含基因修饰的t淋巴细胞标准样品的制备方法、第三方面所述的检测包含基因修饰的t淋巴细胞标准样品的引物探针组合或第四方面所述的包含基因修饰的t淋巴细胞标准样品的拷贝数检测方法中任意一种或至少两种的组合在car-t细胞药物的质量检测中的应用。

44、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

45、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

46、当前现有的拷贝数质控品多是形态结构简单的质粒，而真实检测中所用的样品为细胞，二者差异巨大，会给检测结果带来不可靠风险，更无法对慢病毒载体拷贝数检测操作全过程质控。本发明所述的慢病毒载体基因拷贝数细胞标准样品具有如下优势：(1)临床检测和基因修饰细胞药物中的慢病毒载体基因拷贝数检测结果多在2拷贝/细胞以下，本发明所述的两个t淋巴细胞标准样品分别包含1个慢病毒载体基因拷贝/细胞和2个慢病毒载体基因拷贝/细胞，满足实际质控使用需要；(2)本发明所述的两个t淋巴细胞标准样品的慢病毒载体基因拷贝数量值经过数字pcr、二代测序、流式细胞术多维验证，量值准确可靠且具有溯源性；(3)本发明所述的两个t淋巴细胞标准样品为细胞形态，可以为慢病毒载体基因拷贝数检测全过程质控(包括细胞收集、细胞裂解、基因组dna提取、基因组dna定量、慢病毒载体基因拷贝数定量等)。