一种RCA-GO适配体荧光生物传感器的制备方法及应用于同时对AFB1和OTA进行荧光检测

本发明属于生物传感器及检测，涉及荧光生物传感器，尤其涉及一种rca-go适配体荧光生物传感器的制备方法及应用于同时对黄曲霉毒素b1(afb1)和赭曲霉毒素a(ota)进行荧光检测。

背景技术：

1、真菌毒素是真菌产生的一组次级代谢产物，污染了全球约25％的粮食。黄曲霉毒素b1(afb1)是次生真菌的代谢产物，是自然界中分布最广、毒性最强的一种真菌毒素。赭曲霉毒素a(ota)也是一种真菌毒素，主要由赭曲霉、疣状青霉和碳酸曲霉产生。食品样品中真菌毒素的鉴定可以为食品污染提供早期预警和监测。然而在某些情况下，低浓度或微量对真菌毒素检测构成重大挑战。例如，在谷物污染前阶段，真菌毒素可能不完全代谢，并会产生浓度过低而无法检测的代谢物。因此，这些问题产生了对具有超高灵敏度、高通用性和低背景的粮食作物中真菌毒素的常规定量或定性检测的需求。目前，常用的检测方法包括高效液相色谱、荧光、电化学、免疫测定等。除此之外，还开发了许多信号放大策略来实现超高灵敏度，如聚合酶链式反应(pcr)，杂交链式反应(hcr)、滚环扩增(rca)、催化发夹(cha)和参与该循环的许多脱氧核酶。它们的靶标是循环的，数量可以放大几个数量级，其检测限(lod)可以达到pm或nm。

2、滚圆扩增(rca)是一种等温扩增技术，以单链环状dna分子为模板进行dna合成，产生与环状模板互补的重复序列，产物大小从几百到几万个碱基不等。典型的rca反应需要四种成分：(1)环状dna模板；(2)与rca模板部分互补的dna/rna起始链；(3)具有链置换活性的dna/rna聚合酶；(4)脱氧核苷酸三磷酸酯(dntps)。rca具有简便、高灵敏度、高通量和高选择性等显著优点。因此，这种扩增策略已被广泛应用于核酸、蛋白质和细胞等各种靶标的诊断。

3、基于滚圆扩增(rca)和氧化石墨烯(go)，本发明设计一种同时检测afb1和ota的荧光适配体传感器，该适配体被设计成引物，而padlock则被用作滚圆扩增的模板。在没有目标物的情况下，padlock与适配体杂交，并通过t4dna连接酶环化。随后，phi29聚合酶利用该模板启动rca。随着rca的进行，产生了含有多个目标适配体序列拷贝的单链dna(ssdna)滚动圈扩增产物(rcap)。之后，qds-cdna被用作荧光信号探针。由于cdna(互补dna)与适配体部分互补，cdna将与rcap的多个位点互补，形成rcap/qds-cdna双链分子，这种双链探针无法被对ssdna有更强亲和力的go所猝灭。当目标物存在时，它们会抑制环dna模板(cdt)和ssdna的形成，因为适配体对目标物具有更强的亲和力，导致无法与padlock杂交。因此，只有在没有目标物的情况下才能合成rcap。此外，当目标物浓度较高时，更多的qds-cdna探针被吸附到go表面，并观察到更多的荧光猝灭。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是公开一种能够同时检测食品中两种真菌毒素(afb1和ota)的荧光生物传感器，即rca-go适配体荧光生物传感器的制备方法。

2、为解决现有技术问题，本发明采用的技术方案为：

3、一种rca-go适配体荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)量子点偶联的荧光探针的制备

5、以tris-hcl缓冲溶液为溶剂，配制含有20mg·ml-1的edc和10mg·ml-1的nhs的混合溶液；

6、将2ml g-cnqds、200μl上述edc和nhs混合溶液混合，室温孵育1h以活化表面羧基，加入100μl cdna1，4℃轻轻搅拌12h，10000rpm离心10min，洗涤3次，制得偶联的荧光探针g-cnqds-cdna1；

7、同上步骤，制得偶联的荧光探针cdte qds-cdna2；

8、所制得的量子点偶联的荧光探针(g-cnqds-cdna1和cdte qds-cdna2)分散在2mltris-hcl缓冲液中，4℃储存；

9、其中，所述cdna1和cdna2的浓度均为10nm；所述tris-hcl缓冲溶液的浓度为10mm，ph为8.0；

10、(2)环状dna模板(cdt)的制备

11、将适配体apt即apt 1与apt 2，和滚环模板padlock即padlock 1与padlock2，分别于95℃退火10min，65℃的水浴10min，逐渐冷却至室温；

12、反应体系包含适配体apt、滚环模板padlock、t4连接酶、10×t4连接酶缓冲液和50％ peg 4000缓冲液，以体积比为5～10μl:5～10μl:0.5～1μl:1～2μl:1～2μl，优选6μl:6μl:0.6μl:1.2μl:1.2μl进行混合，用去离子水配至总体积为20μl，22℃水浴孵育，65℃灭活t4连接酶，得混合物，

13、其中，apt 1与padlock 1混合，apt 2与padlock2混合；

14、22℃水浴孵育时间为2h，65℃灭活时间为10min；

15、(3)rcap的制备

16、将10μl步骤(2)的混合物加入rca反应物中，所述rca反应物中含有体积比为1:3:4的phi29聚合酶、10×phi29缓冲液和500μm的dntps，加去离子水使总体积为20μl，37℃孵育10h，65℃终止反应10min，以灭活phi29聚合酶，所得的溶液是滚圈扩增的产物(rcap)；

17、(4)rca-go适配体荧光生物传感器的制备

18、将滚圈扩增的产物(rcap)分别与步骤(1)所制偶联的荧光探针以体积比1:1杂交并用去离子水补充体积至200μl，37℃水浴中反应，加入5μl200mg·ml-1的go溶液混合，37℃孵育30min，制得rca-go适配体荧光生物传感器；

19、其中，rcap与偶联的荧光探针杂交反应时间为1h；37℃水浴中反应1h。

20、序列表

21、

22、本发明所涉及到的cdna1、cdna2、apt 1、padlock 1、apt 2、padlock 2的组成见如上序列表。在制作序列表计算机可读格式文件时，为了验证通过，滚环模板1(padlock 1)与滚环模板2(padlock2)中位于5’的磷酸基删除；互补dna1(cdna1)与互补dna2(cdna2)中的“nh2-”替换为“nh”，特此说明。

23、本发明所使用的dna序列的合成来自于生工生物工程(上海)股份有限公司。

24、本发明的第二个目的在于，公开了所制得rca-go适配体荧光生物传感器的应用，即用于同时对黄曲霉毒素b1(afb1)和赭曲霉毒素a(ota)进行荧光检测。

25、具体的荧光检测方法，包括如下步骤：

26、(a)将含有3μl的0.05、0.1、0.5、1.0、10、25、50和100ng·ml-1的afb1和ota，分别与含有3μl的10nm适配体、3μl的10nm padlock、0.3μlt4连接酶、0.6μl 10×t4连接酶缓冲液和0.6μl 50％ peg 4000的体系混合并以去离子水补体积至20μl，22℃孵育2h，得反应溶液；

27、(b)取10μl反应溶液与0.5μl phi29聚合酶、1.5μl 10×phi29缓冲液和2μl的500μm dntps混合，加去离子水补体积至20μl，37℃孵育10h后灭活phi29聚合酶，得扩增产物；

28、(c)将扩增产物与偶联的荧光探针以体积比1:1杂交并用去离子水补体积至200μl，37℃水浴中反应10h，加入5μl的200mg·ml-1的go溶液，37℃孵育30min，制得rca-go适配体荧光生物传感器，检测溶液的荧光发射峰，绘制荧光强度与对应afb1和ota浓度的标准曲线；

29、(d)取3μl萃取后的待测样品与含有3μl的10nm适配体、3μl的10nm padlock、0.3μlt4连接酶、0.6μl 10×t4连接酶缓冲液和0.6μl 50％ peg 4000的体系混合并补齐体积至20μl，22℃孵育2h；取10μl反应溶液与0.5μl phi29聚合酶、1.5μl 10×phi29缓冲液和2μl的500μm dntps混合，加去离子水使体积为20μl，37℃孵育10h后灭活phi29聚合酶，得扩增产物；将扩增产物与偶联的荧光探针以体积比1:1杂交并用去离子水补充体积至200μl，37℃水浴中反应10h，加入5μl的200mg·ml-1的go溶液混合，37℃孵育30min，测得荧光强度后代入步骤(c)中标准曲线，获得待测样品中的afb1和ota的浓度。

30、本发明较优公开例，步骤(c)中，荧光检测器的激发波长为330nm。

31、本发明较优公开例，步骤(d)中，所述待测样品经如下预处理：称取5g待测样品，37℃，湿度50％，培养20d，加入乙腈-水(85：15，v/v)混合液以10000rpm的转速离心5min，使其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤提纯上清液，其中含有afb1；同样的，向培养20d的样品中加入甲醇-水(70：30，v/v)混合溶剂，以同样的转速和时间进行离心、溶解，用0.22μm的滤膜过滤提纯，其中含有ota；用缓冲溶液将上清液稀释至不同浓度(25、50和100倍)，4℃储存。

32、本发明对afb1的检测限为0.21ng·ml-1，对ota的检测限为0.19ng·ml-1。

33、本发明所述g-cnqds量子点和cdte量子点为市售或自制，以下公开一种自制方法。

34、(1)g-cnqds量子点的制备

35、将柠檬酸钠和尿素混合并研磨成粉末，移入聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，160～200℃加热50～70min，优选180℃加热60min，自然冷却至室温，黑色固体分散在30ml去离子水中，10000rpm离心洗涤除去杂质；抽吸上层溶液置于100da透析袋中透析20～30h，优选24h，即得g-cnqds量子点；所述柠檬酸钠和尿素的摩尔比为1～2:3～8，优选1:6。

36、(2)cdte qds量子点的制备

37、将硼氢化钠和碲粉溶于去离子水中通氮气以去除氧气，4℃静置2～8h，优选4h得碲氢化钠溶液；其中，硼氢化钠、碲粉的质量比为0.06～0.09:0.01～0.02，优选0.084:0.0125；

38、将氯化镉、3-巯基丙酸mpa溶于蒸馏水，在氮气中快速搅拌，逐滴加入氢氧化钠溶液调ph至9～10，快速移液碲氢化钠溶液，100℃恒温水浴中回流2.5h后用丙酮洗涤，产物即为cdte量子点；其中，氯化镉、3-巯基丙酸、蒸馏水和碲氢化钠溶液的反应物料比例为0.05～0.06g:30～40μl:20～30ml:0.8～1.5ml，优选0.057g:37μl:25ml:1ml，氢氧化钠的浓度为1m。

39、本发明以石墨相氮化碳量子点(graphite phase carbon nitride quantumdots,g-cnqds)和cdte量子点(cdte quantum dots，cdte qds)为能量供体，将其与互补dna(cdna)偶联作为信号探针(a)，氧化石墨烯(go)为猝灭剂，对目标物进行特异性识别，利用滚环模板(padlock)与适配体结合并触发滚环扩增反应(rca)进行信号放大从而对目标物实现高灵敏检测，实现对目标物的同时检测。在没有目标物的情况下，将滚环模板(padlock)与适配体结合并触发滚环扩增反应(rca)来获得扩增后的产物(rcap)，rcap与信号探针形成rcap/qds-cdna双链体(b)。这种双链体不能吸附到go上，因此荧光没有被猝灭。在afb1和ota存在的情况下，适配体识别目标物并形成复合物，适配体无法与滚环模板结合，因此没有rca和双链形成，信号探针被go吸附导致荧光猝灭，从而实现高灵敏检测。

40、当目标物afb1和ota存在时，适配体被设计为引物，padlock被用作滚圈扩增的模板。适配体对目标物具有更高的亲和力，导致目标物会特异性地优先与其对应的适配体相结合，导致无法与padlock杂交，从而抑制环状dna模板(cdt)和滚圈扩增产物(rcap)的形成。因此，rcap只能在没有目标物的情况下合成。此外，当靶标浓度较低时，rcap较多，qds-cdna探针会与rcap杂交形成双链结构，导致无法吸附在go表面，荧光没有被猝灭，荧光强度较高。当靶标浓度较高时，更多的qds-cdna探针被go吸附，荧光猝灭，荧光强度下降。通过荧光共振能量转移(fret)和滚圈扩增策略，实现对食品中afb1和ota同时进行检测。

41、有益效果

42、本发明所使用量子点材料制备成本低、偶联活性强、制备方法成熟稳定；未与目标物结合的适配体与padlock结合形成cdt，进行滚圈扩增反应，使荧光信号大大增强，实现对afb1和ota的检测，理论基础成熟，可靠性好；与量子点偶联后的荧光探针信号稳定，灵敏度强，形成的双链结构(rcap/qds-cdna)稳定性好，不易产生假阳性信号。该方法操作较为简单、灵敏度高且背景信号低，适用于高灵敏检测分析，具有成本低的优点。所公开的方法能够应用于测定实际样品中的afb1和ota。