一种靶向根除耐药幽门螺杆菌的多功能级联纳米酶及其制备方法和用途

本发明属于生物，具体涉及一靶向根除耐药幽门螺杆菌（ h. pylori）的多功能级联纳米酶的制备方法、抗菌机制和抗敏感性及耐药性 h. pylori感染的实验方法。

背景技术：

1、幽门螺杆菌( h. pylori)是一种革兰氏阴性、弯曲的微需氧杆菌，在20世纪80年代早期由warren和marshall在胃活检中首次发现。其被认为是胃炎、消化性溃疡、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的主要病因和胃癌的危险因素。除了胃肠道疾病，幽门螺旋杆菌还在消化道外疾病中起作用，包括免疫血小板减少性紫癜、不明原因的缺铁性贫血和维生素b12缺乏症。世界卫生组织和国际癌症研究机构将幽门螺旋杆菌定义为一类致癌物。

2、幽门螺旋杆菌长期感染世界上一半以上的人口，尽管发达国家的 h. pylori感染率稳步下降，但在发展中国家， h. pylori的患病率仍然很高(高达80%)，且临床实践证明， h. pylori感染不易治愈。因此众多患者的幽门螺旋杆菌早期根除非常必要，而 h. pylori感染的抗生素治疗是复杂的，一般是使用两种抗生素和一种酸抑制剂。因为 h. pylori定位于胃粘膜的酸性表面，所以需要一种酸性抑制剂来维持恒定的ph值，从而提高抗生素的疗效。根除 h的一线治疗方案是标准的三联疗法，包括质子泵抑制剂(ppi)、阿莫西林和克拉霉素，或含铋四联疗法。然而，在一些地区，标准三联疗法根除率已低于《马斯特里赫特条约》的80%，含氟喹诺酮类药物治疗已作为二线或三线治疗用于抢救治疗。不幸的是， h. pylori对氟喹诺酮类药物的耐药性最近也有所增加。

3、目前抗生素耐药性是影响 h. pylori的根除治疗方案疗效的主要因素。hp对一线抗生素的耐药率(包括多重耐药率)呈逐年上升趋势，并且耐药率有一定的地区差异。近些年的多项研究都证实了幽门螺旋杆菌对抗生素的耐药性在世界范围内迅速上升，特别是克拉霉素，其耐药性在日本和意大利达到30%，在中国甚至高达50%。这导致幽门螺旋杆菌的抗菌药物根除率一直下降，一项研究表明敏感菌株的根除率约为88%，而耐药菌株的根除率仅为18%。除了耐药性的增加，复杂的抗生素疗法也降低了患者的依从性，这些都导致了幽门螺旋杆菌根除率的下降。此外，抗生素也会扰乱人体的肠道菌群，造成严重的副作用，影响体内多种有益的生理和代谢过程。因此，开发其它的治疗方法已是当务之急。

4、最近，纳米酶已经成为对抗细菌感染的有希望的“抗生素”。目前，已有多篇报道应用了具有氧化酶和过氧化物酶样活性的纳米酶用于抗菌治疗，并取得了良好的治疗效果。但是目前已经报道的纳米酶的多酶活性仍有待提高，以提高抗菌抗炎效果。普鲁士蓝纳米颗粒(pbnps)及其类似物因其优异的生物相容性已成为临床应用中最重要的纳米酶之一，其具有多酶样活性，包括过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)和超氧化物歧化酶(sod)活性，已被用于在肿瘤微环境中过量ros存在的情况下催化h2o2转化为o2，实现o2的自供应，同时可有效清除ros，调节氧化应激，其内在机制与pbnps的容量降低和低氧化还原电位有关。二茂铁是芬顿反应的催化剂，可通过芬顿反应生成羟基自由基加强纳米材料的pod样活性。co3o4nps是一种金属氧化物，被报道具有ph依赖性多酶样活性，包括过氧化氢酶（cat）样、过氧化物酶（pod）样、超氧化物歧化酶(sod)样和氧化酶（oxd）样活性,并且co3o4nps已被证明对致病菌具有良好的抗菌活性。同时，壳聚糖可以促进纳米颗粒在纳米颗粒-细菌界面的相互作用。

技术实现思路

1、为了克服上述目前 h. pylori根除过程中面临的困难，本发明的目的在于提供一种靶向根除耐药 h. pylori的多功能级联纳米酶（fpb-co-ch nps）的制备方法，抗菌机制和应用，解决现有的抗 h. pylori药物靶向性较差，药效不显著的问题。受 h. pylori微需氧特性的启发，本发明所构建的具有ph选择性的增强的多功能级联纳米酶，可通过级联酶促反应，创建一个富氧环境来抑制 h. pylori的生长，以有针对性地有效根除和预防 h. pylori的复发。

2、在pbnps中引入二茂铁形成的新型普鲁士蓝类似物纳米粒子可通过二茂铁催化的芬顿反应进一步增强纳米酶的过氧化物酶（pod）样活性。进一步结合co3o4nps的新型普鲁士蓝类似物纳米粒子有望实现纳米酶的ph选择性多酶样活性增强，以实现更强的治疗效果。包覆壳聚糖后，可以提高纳米材料的电正性，使其更好的与细菌菌体发生静电吸附。

3、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

4、本发明公开了一种多功能级联纳米酶的制备方法、抗菌机制和其抗敏感型和耐药型 h. pylori感染的实验方法，多功能级联纳米酶的制备方法包括合成新型普鲁士蓝类似物后作为核心，包覆co3o4nps，最外层再修饰壳聚糖涂层，形成复合纳米酶fpb-co-ch nps。

5、优选地，所述作为核心新型普鲁士蓝类似物（fpb nps）的合成制备方法包括在稀盐酸溶液(0.1 mm)中，摩尔浓度比1:1的完全溶解于超纯水的k3[fe(cn)6]和完全溶解于无水乙醇的fc(cooh)2室温搅拌6 h混合而成，洗脱冻干后低温保存。

6、优选地，所述新型普鲁士蓝类似物包覆co3o4nps得到fpb-co nps的方法包括在纯净水中，质量比为2.8：1：151的fpb nps，cocl2·6 h2o和尿素均匀混合后，在80℃的高压釜中反应24 h，洗脱干燥后低温保存。

7、优选地，所述fpb-co nps最外层再修饰壳聚糖涂层，形成复合纳米酶fpb-co-chnps 的方法包括在超纯水中质量比4:1的pfb-co nps壳聚糖季铵盐均匀混合后，室温搅拌2h，得到pfb-co-ch nps, 洗脱干燥后低温保存。

8、优选地，所述一种多功能级联纳米酶的抗菌机制为：通过ⅰ-iv的纳米酶级联循环过程，不断放大反应，增加胃内氧气含量与化学动力学疗法产物·oh，以协同抑制微需氧特性的 h. pylori，同时减少因感染 h. pylori引起胃粘膜组织炎症反应中的ros来抗炎与修复胃黏膜组织，纳米酶级联催化过程如下：

9、ⅰ、以·o2-为底物，通过sod酶样活性，转化为h2o2 和o2；

10、ⅱ、通过cat酶样活性,将h2o2转化为o2；

11、ⅲ、通过pod酶样活性,将h2o2转化为·oh；

12、iv、通过pod酶样活性，将o2 转化为 ·o2-。

13、优选地，所述一种多功能级联纳米酶抗敏感型和耐药型 h. pylori感染的实验方法包括：

14、ⅰ、通过体外细菌培养实验检测该纳米酶对 h. pylori的抑菌率，通过平板计数和细菌活死染色后共聚焦显微镜观察结果；

15、ⅱ、利用透射电镜观察纳米酶对 h. pylori菌膜的直接损伤作用；

16、ⅲ、通过菌体内β-糖苷酶水平检测和菌体内ros水平检测考察纳米酶对 h. pylori菌体内代谢的间接损伤作用；

17、iv、通过灌胃构建敏感型和耐药型 h. pylori感染小鼠模型，然后对比使用该纳米酶和抗生素治疗效果区别。

18、v、通过灌胃构建敏感型和耐药型 h. pylori感染小鼠模型方法，包括以下步骤：使用c57bl/6jn小鼠，分别感染敏感hp菌株（atcc 43504）和临床耐药hp菌株。断水断食12 h后，接种hp，每只小鼠灌胃500 μl麦氏浊度1.0（3×108个/ml）的hp菌悬液，隔一天一次，共7次。

19、vi、根据步骤ⅰ到步骤iv的结果分析确定纳米酶抗 h. pylori感染的特性。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、本发明提供的一种靶向治疗 h. pylori的多功能级联纳米酶，（1）纳米酶作为天然酶的替代品，是非免疫原性的，易于生成、储存和运输，由于其固有的催化性能、高稳定性、可调节的理化性质和对环境的响应性，可以在更大范围的条件下工作，如ph、温度、盐浓度、氧化还原微环境等，已被构建为用于生物医学的级联催化体系。本专利提出的一种多功能纳米酶，作为非载药单纳米酶药物，廉价易得，可以在酸性环境中保持稳定性并且特异性的启动级联酶促反应，以消灭耐药的 h. pylori，具有良好临床应用前景。（2）抗菌机制：co3o4包覆新型普鲁士蓝类似物的co-fe纳米酶表现出类似氧化酶（oxd）-、超氧化物歧化酶(sod)-、过氧化物酶(pod)-和过氧化氢酶(cat)-的酶活性，这些活性可以自供应o2,形成不利于 h. pylori生存的富氧环境，o2也可与多种细胞因子相互作用，促进血管生成，调节增殖和迁移；同时，纳米酶可触发·oh生成，破坏菌膜，实现化学动力学抗菌治疗，从而杀死胃中的 h. pylori；最后，通过不断消耗·o2-和h2o2，调节因 h. pylori感染造成的胃内炎症组织的氧化应激，缓解炎症，同时恢复受损的胃粘膜。（3）壳聚糖具有多阳离子结构，可与革兰氏阴性表面的主要阴离子成分脂多糖、蛋白质相互作用，并具有一定的抗菌作用，这可能是通过结合并削弱外膜的屏障功能。细菌的外膜在保护生物体方面起着至关重要的作用。本专利对复合纳米酶进行壳聚糖表面修饰，发挥细菌靶向粘附作用，提高复合材料的生物相容性。本专利评估了其在体内选择性治疗敏感和耐药 h. pylori感染的潜力，尤其对于耐药的 h. pylori，这种酸性环境激活的多功能纳米酶比标准的一线三联疗法更有效。此外，fpb-co-ch nps的级联多功能纳米酶特性在肠道中性条件下被抑制，从而避免了抗生素引起的胃肠道菌群平衡失调。总之，这种基于胃酸活化产氧系统的fpb-co-ch nps多功能级联纳米酶活性有望克服选择性治疗 h. pylori感染的关键挑战。与一线抗生素治疗相比，该平台结合了根除耐药细菌、调节炎症、修复功能和避免肠道菌群失调的能力。