一种以PEG10蛋白为载体的纳米颗粒及其制备方法和应用

本发明属于生物工程，具体而言，涉及具有免疫增强效应的以peg10蛋白为载体的纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、纳米载体在新型疫苗设计中具有突出作用，能够实现抗原表面多价展示，增强抗原递呈细胞摄取，激活产生高效免疫反应。作为一种重要的疫苗载体，病毒样颗粒（virus-like particle, vlp）具有高生物相容性和强免疫原性，已被广泛用于乙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒等病原体新型疫苗的研发。然而，病毒来源的自组装蛋白较易产生免疫印记效应，作为分子骨架递送其他抗原时，保护性免疫反应可能受到一定程度的抑制。开发低免疫原性的自组装蛋白疫苗递送载体，能够进一步提升其安全性和免疫特异性。

2、peg10（paternally expressed gene 10，peg10）蛋白是人体天然存在的一种逆转录转座子衍生蛋白，包含与逆转录病毒gag相似的蛋白结构。peg10在胞内自组装形成病毒样细胞外囊泡，包裹其自身的mrna并分泌至胞外，介导peg10 mrna在细胞间转移。peg10这一特性使其具有被开发成为递送载体的潜力。本发明的目的就是设计制备基于peg10蛋白质纳米颗粒的疫苗载体，高效激活产生对靶标抗原的特异性免疫反应。

技术实现思路

1、基于上述目的，本发明首先提供了一种以peg10短同源异构体作为载体荷载和/或递送多肽的纳米颗粒，所述纳米颗粒是由含peg10短同源异构体的第一重组蛋白与含被荷载和/或递送的多肽的第二重组蛋白相偶联并自组装形成的纳米颗粒，其中，由peg10短同源异构体与第一分子接头融合为第一重组蛋白，被荷载和/或递送的多肽与第二分子接头融合为第二重组蛋白，所述第一分子接头与第二分子接头为可以特异性偶联的一对分子连接肽。

2、在本发明的技术方案中，所述的peg10短同源异构体是peg10（paternallyexpressed gene 10，peg10）的一种异构体。所述peg10是人体天然存在的一种逆转录转座子衍生蛋白，peg10的基因能够编码产生两种同源异构体，氨基酸序列长度分别为325（短同源异构体）和708（长同源异构体），peg10短同源异构体的蛋白具有与逆转录病毒gag结构蛋白相似的特征，更有潜力形成类病毒纳米颗粒，在本发明中所述及的peg10均是指peg10短同源异构体。所述多肽是指3个以上的 α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物。所述的蛋白质之间的偶联是指通过对蛋白质特定位点的氨基酸残基进行修饰而使两个或多个蛋白质通过非共价化学键（如脯氨酸磷酸化、蛋白质泛素化等）或共价化学键（如二硫键）相互结合形成复合物的过程。所述分子连接肽是指可以发生上述修饰而形成非共价化学键或共价化学键并彼此发生偶联的两个分子接头，即，所述的第一分子接头与第二分子接头。

3、在一个优选的技术方案中，所述多肽包括抗原、抗体、酶和功能肽的一种或多种。在本发明的技术方案中，所述功能肽是指在体内担负着重要调节功能的肽类物质。基于本发明的构思，peg10蛋白均可以通过与上述的抗原、抗体、酶和功能肽的偶联并发生自组装而形成纳米颗粒。

4、在另一个优选的技术方案中，所述的一对分子连接肽为spytag肽与spycatcher肽。在本发明的技术方案中，所述spytag肽与spycatcher肽是指在革兰氏阳性菌酿脓链球菌（ streptococcuspyogenes）的菌毛蛋白中分离的可以自发形成异肽键的多肽片段，分别称为spytag（16个氨基酸）和spycatcher（113个氨基酸），其中spytag的asp117可以和spycatcher的lys31可以自发地脱水形成异肽键。本领域技术人员可以明白，基于本发明的构思，使用本领域的其它配对的分子连接肽分别与peg10蛋白和被荷载和/或递送的多肽融合，同样可以实施本发明，即，形成由peg10蛋白和被荷载和/或递送的多肽自组装的纳米颗粒。

5、在一个更为优选的技术方案中，所述peg10蛋白与spycatcher肽融合为第一重组蛋白，所述多肽与spytag肽融合为第二重组蛋白。

6、更为优选地，所述多肽为猴痘病毒m1r抗原。本领域技术人员可以明白，基于本发明的构思，其它的用于刺激机体免疫系统产生保护性抗体的免疫原也可以用于本发明的所述的抗原与peg10蛋白自组装形成纳米颗粒。

7、尤为优选地，在所述第一重组蛋白中，序列如seq id no:1所示的peg10蛋白位于c端，序列如seq id no:5所示的spycatcher3位于n端，所述第一重组蛋白被命名为“sc3-peg10蛋白”；以及

8、在所述第二重组蛋白中，序列如seq id no:14的猴痘病毒m1r抗原位于n端，序列如seq id no:11的spytag3位于c端，所述第二重组蛋白被命名为“ m1r-st3”。

9、在另一个优选的技术方案中，所述第一重组蛋白中序列如seq id no:1所示的peg10蛋白位于c端，序列如seq id no:5所示的spycatcher3位于n端（sc3- peg10蛋白）；以及，

10、在所述第二重组蛋白中，序列如seq id no:8所示的细胞穿透肽tat位于c端，序列如seq id no:11所示的spytag3位于n端，所述第二重组蛋白被命名为“st3-tat”。

11、其次，本发明提供了上述的纳米颗粒在制备疫苗中的应用。本发明提供的纳米颗粒是基于peg10蛋白的自组装，被组装和荷载的抗原在体内显示了增强的免疫原性，以及，体外和体内递呈均可激活抗原递呈细胞，并且可以增强抗原的体内驻留时间，延长抗原积累并促进dc在体内成熟，显示其具有自佐剂效应，因此，本发明提供的纳米颗粒显示了在制备疫苗中的应用前景。

12、再次，本发明提供了上述的纳米颗粒在制备细胞内治疗药物的应用，所述纳米颗粒还荷载有需要递送至细胞内的药物。本发明的一个实施方案显示，基于peg10蛋白与细胞穿透肽tat自组装的纳米颗粒可以高效穿透至hela细胞，且细胞穿透效果优于基因融合，因此，基于本发明的构思，使用peg10蛋白与细胞穿透肽tat偶联拼接的纳米颗粒为载体，可以将该纳米颗粒与待递送至细胞内的药物以偶联、基因融合或者标记的方式将所述药物递送至靶细胞内部。因此，本发明提供了上述的纳米颗粒具有制备细胞内治疗药物的应用前景。

13、最后，本发明提供了上述的的纳米颗粒的方法，所述方法包括如下步骤：

14、（1）分别制备第一重组蛋白与第二重组蛋白；

15、（2）将第一重组蛋白与第二重组蛋白混合。

16、在一个优选的技术方案中，在步骤（1）中，以序列如seq id no: 7所示的编码序列制备第一重组蛋白（sc3- peg10蛋白），以及

17、以如seq id no:13所示的序列化学合成第二重组蛋白（st3-tat），或

18、以如seq id no:16所示的编码序列制备第二重组蛋白（m1r-st3）。

19、在本发明的具体实施方案中上述的编码序列均是经过优化后的dna 序列，并且添加了纯化标签，通过所述方法可以获得高纯度的重组蛋白，满足了其进一步制备纳米颗粒的技术需求。

20、在另一个优选的技术方案中，在步骤（2）中，所述第一重组蛋白与第二重组蛋白混合的摩尔比例为0.5-2:1。在本发明的具体实施方案中，根据荷载蛋白质的不同，第一重组蛋白与第二重组蛋白具有不同的优选的混合摩尔比例，例如，sc3- peg10蛋白与 m1r-st3以1：1的摩尔比混合，sc3- peg10与st3-tat以2: 1的摩尔比混合。

21、本发明提供了一种基于peg10蛋白的疫苗递送载体，通过模块拼接能够与蛋白抗原在体外自组装形成能将抗原高效多价展示的纳米颗粒, 在本发明提供的所述纳米颗粒在作为疫苗制剂的应用中，所述纳米颗粒可以显著提升特异性抗体和中和抗体的滴度。与m1r-st3相比，m1r-peg10纳米颗粒诱导产生更高水平的m1r特异性免疫反应，其中第14天增加了247.3倍，第28天增加了48.5倍，第42天增加了40.4倍。

22、另外，本发明提供的基于peg10蛋白与细胞穿透肽tat自组装的纳米颗粒可以高效穿透至hela细胞，且细胞穿透效果优于基因融合，显示其可以作为向细胞内递送药物的载体。

23、因此，本发明提供的纳米颗粒有望作为一种安全、通用、高效的内源性重组蛋白质递送载体，提升靶标抗原的免疫原性，具有作为疫苗制备应用和细胞内递送载体的应用前景。